Blot Protein Barat | Imunologi

Blot Protein Barat!

Protein didenaturasi melalui inkubasi dengan detergen ionik (SDS: sodium dodecyl sulfate) pada suhu 100°C.

SDS melapisi semua protein secara seragam dan membuat muatan permukaan protein menjadi negatif.

sebuah†”

Protein terdenaturasi kemudian dielektroforesis dalam gel poliakrilamida. Protein dipisahkan sebagai pita berbeda tergantung pada berat molekulnya.

sebuah†”

Protein yang dipisahkan adalah sekutu elektroforesis yang ditransfer ke kertas saring (nilon atau nitroselulosa).

sebuah†”

Kertas saring kemudian diinkubasi dengan antisera terhadap protein. Antibodi mengikat antigen protein yang sesuai pada kertas saring dan membentuk kompleks antigen-antibodi.

sebuah†”

Kertas saring dicuci untuk menghilangkan komponen serum yang tidak terikat.

sebuah†”

Enzim berlabel anti-imunoglobulin (dikenal sebagai konjugat) ditambahkan ke kertas saring dan diinkubasi.

sebuah†”

Konjugat berikatan dengan antibodi di kompleks antigen-antibodi di kertas saring.

sebuah†”

Kertas saring dicuci untuk menghilangkan konjugat yang tidak terikat dan substrat ditambahkan dan diinkubasi.

saya. Pita berwarna berkembang di tempat-tempat di mana terdapat kompleks antigen-antibodi.

aku aku aku. Tidak berkembangnya pita menunjukkan bahwa antibodi yang sesuai terhadap antigen tidak ada dalam serum uji.

Kertas saring yang diresapi dengan antigen dapat disimpan untuk waktu yang lebih lama.

Western blot assay banyak digunakan untuk mendeteksi antibodi virus Hepatitis C dan sebagai tes konfirmasi untuk mendeteksi antibodi terhadap human immunodeficiency virus (HIV).

Perusahaan komersial menghamili kertas saring dengan antigen HIV yang terpisah dan memasok ke laboratorium. Di laboratorium, serum pasien ditambahkan ke kertas saring dan diproses untuk mendeteksi keberadaan antibodi spesifik HIV di dalam serum.

Radioimmunoassay:

Radioimmunoassay (RIA) pertama kali dikembangkan oleh Rosalin Yalow dan Berson (1959). Banyak variasi dalam metode telah diperkenalkan. Ada dua teknik RIA utama, RIA kompetitif dan RIA nonkompetitif.

Radioisotop yang berbeda digunakan sebagai label (Tabel 27.4) dan emisi radioaktif diukur dalam hitungan per menit (CPM) dengan menggunakan pencacah sintilasi. Label yang paling populer, ¹²⁵ I memerlukan waktu yang lebih singkat untuk penghitungan sinyal, tetapi memiliki umur simpan yang terbatas karena waktu paruhnya yang singkat. Tritium ( ³ H) radioisotop membutuhkan waktu yang lebih lama untuk menghitung dan karenanya total waktu pengujian meningkat.

Keunggulan RIA adalah:

saya. Presisi dan kualitas tinggi

1. Konjugasi isotop itu mudah

aku aku aku. Deteksi sinyal tanpa pengoptimalan

Tabel 27.4: Sifat radioisotop yang digunakan dalam uji radioimuno:

Namun, RIA memiliki kelemahan sebagai berikut

saya. Waktu paruh reagen pendek

1. Bahaya radioaktif.