Metode Pengujian Histokompatibilitas!
Sistem HLA sangat polimorfik. Sifat polimorfik alel HLA awalnya ditemukan dan ditentukan dengan metode serologis dan antigen HLA diberi nomor. Belakangan ditemukan bahwa antigen dengan spesifisitas serologis yang sama mungkin memiliki urutan asam amino yang berbeda. Pada tahun 1999, jumlah alel HLA yang diketahui melebihi 1000, dan jumlahnya terus meningkat. Karena polimorfisme yang luas, nomenklatur alel HLA menjadi kompleks dan juga sulit bagi seseorang untuk memahami nomenklatur tersebut, kecuali jika orang tersebut berada di bidang histokompatibilitas.
Alel sekuensing pertama diberi nama dengan dua digit yang sesuai dengan spesifisitas serologisnya. Dua digit pertama diikuti oleh dua digit lainnya yang menunjukkan urutan kronologis penamaan oleh Komite Nomenklatur WHO untuk Faktor Sistem HLA. (Misalnya. Urutan alel pertama dari gen HLA-A2 diberi nama HLA-A 0201, dan urutan alel kedua diberi nama HLA-A 0202.)
Pengetikan HLA dilakukan dengan metode pengetikan serologis atau metode pengetikan molekuler. Metode pengetikan HLA serologis mendeteksi epitop molekul HLA, sedangkan metode molekuler mendeteksi urutan nukleotida.
saya. Pengetikan HLA yang mendefinisikan kelompok alel (biasanya mendekati spesifisitas serologis) disebut sebagai pengetikan generik atau resolusi rendah (Misalnya, HLA-DRBl-04).
- Pengetikan yang menyelesaikan semua alel yang diketahui disebut sebagai pengetikan HLA resolusi tinggi (Misalnya, HLA-DR BI x401).
aku aku aku. Pengetikan yang mengatasi spesifisitas serologis tetapi tidak mencapai tingkat alel disebut sebagai pengetikan resolusi menengah (Misalnya, HLA-DRBl-0401/09/13/16/21/26/33).
Program Donor Sumsum Nasional telah membuat kode untuk memfasilitasi pengelolaan data resolusi menengah yang rumit ini. Dalam sistem ini, nama untuk HLA-BRBl-0401/09/13/16/21/26/23/ adalah DRBL- 04EJV.
Pengujian Histokompatibilitas Dengan Metode Serologis:
Limfosit digunakan untuk pengetikan HLA serologis, skrining antibodi, dan pencocokan silang.
Isolasi Limfosit untuk Pengetikan HLA:
saya. Darah vena perifer dicampur dengan Ficoll-Hypaque dan disentrifugasi. Lapisan yang mengandung sel mononuklear darah tepi disedot, dicuci, dan digunakan.
- Limfosit yang diisolasi dari kelenjar getah bening dan limpa mayat digunakan.
aku aku aku. Pengetikan HLA untuk antigen kelas II dilakukan dengan populasi sel B yang diperkaya (Sekitar 80 persen sel T darah perifer normal adalah sel T istirahat yang kekurangan antigen kelas II pada permukaannya).
- Manik-manik magnetik berlapis mAb anti-CD2 atau anti-CD3 digunakan untuk mengisolasi sel T; dan manik-manik magnetik berlapis mAbs anti-CD19 digunakan untuk mengisolasi sel B.
Deteksi Antigen HLA Limfosit:
Uji sitotoksisitas mikro adalah uji sitotoksisitas getah bening yang bergantung pada komplemen. Baki pengetikan beku berisi sumur yang dilapisi dengan antibodi berbeda terhadap antigen HLA tersedia secara komersial.
Kira-kira 2000 limfosit dibagikan ke dalam masing-masing lubang nampan dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. (Antibodi di setiap sumur berikatan dengan antigen HLA spesifik pada permukaan limfosit, jika ada.)
sebuah†”
Lima µl komplemen (biasanya, serum kelinci) ditambahkan ke masing-masing sumur dan diinkubasi selama 60 menit, (komplemen protein menyebabkan kematian limfosit yang dilapisi mAb. Dengan tidak adanya mAb yang berikatan dengan limfosit, komplemen tidak aktif dan limfosit tidak dibunuh).
sebuah†”
Pewarna eosin Y, diikuti formaldehida (formaldehida memperbaiki reaksi) ditambahkan.
sebuah†”
Kemudian sel mati dan sel hidup di setiap sumur dihitung di bawah mikroskop kontras fase.
saya. Sel bengkak dan gelap adalah sel mati (Pewarna eosin Y masuk ke dalam sel mati).
- Sel terang dan refraktil adalah sel hidup (Pewarna eosin Y tidak masuk ke dalam sel hidup).
Setiap sumur di baki dilihat secara individual untuk sel mati dan sel hidup. Persentase sel mati di setiap sumur dihitung dan penilaian dilakukan sesuai Tabel 27.5.
Tabel 27.5: Penilaian uji sitotoksisitas getah bening untuk HLA :
|
Persentase limfosit mati di dalam sumur |
Skor |
Penafsiran |
|
0-10 |
1 |
Negatif |
|
11-20 |
2 |
Diragukan positif |
|
21-50 |
4 |
Positif lemah |
|
51-80 |
6 |
Positif |
|
81-100 |
8 |
Positif kuat |
Jenis HLA seseorang ditentukan oleh interpretasi reaksi limfosit individu dengan antisera berbeda yang digunakan dalam uji sitotoksisitas limfatik yang bergantung pada komplemen.
saya. Setiap individu diharapkan memiliki dua antigen HLA-A, dua HLA-B, dan dua antigen HLA-C pada permukaan limfosit.
- Jika seseorang hanya menunjukkan satu antigen HLA-A atau HLA-B atau HLA-C dalam tes, kemungkinan individu tersebut homozigot untuk antigen tertentu atau panel antisera yang digunakan dalam tes tidak memiliki antibodi spesifik terhadap yang kedua. antigen atau terdapat ekspresi molekul HLA yang rendah pada permukaan limfosit.
Uji sitotoksisitas getah bening yang bergantung pada komplemen untuk antigen HLA-DR dan HLA-DQ dilakukan dengan menggunakan sel B yang diisolasi oleh manik-manik magnetik berlapis mAB atau sel B yang diisolasi di atas wol nilon.
Sebagian besar serum tipe HLA diperoleh dari wanita multipara. Karena wanita multipara berulang kali terpapar antigen HLA janin, serum wanita multipara memiliki antibodi terhadap antigen HLA. Hampir 200 antisera yang berbeda digunakan untuk membentuk antigen HLA seseorang.
Awalnya diperkirakan bahwa mAb untuk masing-masing antigen HLA dapat dikembangkan dan pengetikan HLA akan sederhana. Tetapi banyak mAb berikatan dengan epitop umum daripada ke epitop pribadi antigen HLA. Selain itu, banyak mAb murine tidak memperbaiki komplemen (dan karenanya penggunaannya dalam tes sitotoksisitas limfatik dependen-komplemen terbatas).
Namun, mAb murine dapat digunakan dalam metode ELISA dan metode flow cytometry, yang tidak memerlukan komplemen. Akhir-akhir ini, banyak laboratorium lebih suka menggunakan pengetikan HLA molekuler, daripada pengetikan HLA serologis.
Skrining Serum Penerima Transplantasi untuk Antibodi terhadap Antigen l-ILA (skrining Antibodi):
Kehadiran antibodi terhadap antigen HLA dalam serum penerima transplantasi organ yang menunggu biasanya dilakukan oleh sitotoksisitas getah bening yang bergantung pada komplemen. Limfosit dengan antigen dan komplemen HLA yang diketahui dicampur dengan serum penerima. Setelah inkubasi yang tepat, limfosit mati dan limfosit hidup dihitung. Persen antibodi reaktif panel (PRA) kemudian dihitung.
PRA = Jumlah sel positif / Jumlah sel panel total x 100
PRA menunjukkan tingkat kepekaan penerima yang menunggu terhadap antigen HLA.
Metode ELISA untuk Menapis Antibodi HLA Serum:
Metode ELISA mudah, cepat, dan tidak memerlukan limfosit hidup maupun komplemen. Antigen HLA yang dimurnikan dengan afinitas dilapisi pada dinding pelat mikrotiter
sebuah†”
Serum penerima ditambahkan dan diinkubasi
sebuah†”
Setelah dicuci, enzim IgG anti-manusia terkonjugasi ditambahkan dan diinkubasi.
sebuah†”
Setelah dicuci, substrat ditambahkan dan diinkubasi.
saya. Perkembangan warna pada sumur tertentu menunjukkan adanya antibodi IgG terhadap antigen HLA yang dilapisi pada sumur tersebut.
- Tidak berkembangnya warna pada sumur tertentu menunjukkan tidak adanya antibodi terhadap antigen HLA tertentu yang terlapisi pada sumur tersebut.
Flow Cytometer untuk Mendeteksi Antibodi HLA Serum:
Manik-manik mikro yang dilapisi dengan antigen HLA diinkubasi dengan serum pasien dan kemudian dengan antibodi IgG anti-manusia berlabel neon. Persentase manik-manik yang ternoda di atas latar belakang memberikan ukuran persen antibodi reaktif panel (PRA) pasien.
Pencocokan Silang:
Jika darah penerima yang menunggu mengandung antibodi terhadap antigen HLA donor, antigen HLA pada sel donor akan diserang oleh antibodi penerima, setelah transplantasi. Oleh karena itu sebelum transplantasi, penting untuk mengetahui apakah penerima memiliki antibodi terhadap antigen HLA donor.
Jika antibodi spesifik antigen HLA donor ada dalam serum penerima, transplantasi akan ditolak. Pencocokan silang dilakukan untuk mendeteksi keberadaan antibodi serum penerima yang menunggu terhadap antigen HLA donor yang diusulkan.
Pencocokan silang sitotoksisitas getah bening dengan Limfosit Darah Tepi:
Limfosit darah tepi dari donor yang diusulkan (yang kira-kira mengandung 80 persen sel T (yang mengandung antigen MHC kelas I) dan 20 persen sel B dan monosit (yang mengandung antigen MHC kelas I dan kelas II) dicampur dengan serum penerima yang menunggu dan diinkubasi. .
sebuah†”
Pelengkap ditambahkan dan diinkubasi.
sebuah†”
Pewarna eosin Y ditambahkan dan diinkubasi.
saya. Jumlah sel mati dan hidup dihitung dan persentase sel mati dihitung. Kematian sel 50 persen atau lebih menunjukkan kecocokan silang positif yang kuat (yaitu, serum penerima memiliki antibodi yang mampu bereaksi dengan antigen HLA donor). Pencocokan silang positif yang kuat antara penerima dan donor yang diusulkan merupakan kontraindikasi untuk transplantasi organ dari donor ke penerima.
Untuk mengetahui apakah antibodi penerima ditujukan terhadap antigen kelas I atau kelas II, dilakukan pencocokan silang sitotoksisitas limfa sel T (menggunakan sel T yang diperkaya) atau pencocokan silang sitotoksisitas limfa sel B (menggunakan sel B yang diperkaya).
Pencocokan silang flow cytometer 30-250 kali lebih sensitif daripada metode serologis visual untuk mendeteksi antibodi IgG terhadap antigen HLA pada permukaan limfosit.
Limfosit darah tepi dari donor yang diusulkan diinkubasi dengan mAb anti-CD3 berlabel (Misalnya, pewarna fluoresen yang memancarkan cahaya hijau), yang berikatan dengan sel T.
sebuah†”
Sel T terikat ani-CD3 berlabel dipisahkan dari sel B dalam flow cytometer.
sebuah†”
Sel T yang terpisah dan bernoda sekarang diinkubasi dengan serum penerima yang menunggu.
saya. Antibodi serum penerima terhadap antigen HLA sel T donor, jika ada, akan berikatan dengan sel T.
sebuah†”
Setelah dicuci, flurochrome (yang mengeluarkan warna, selain hijau, katakanlah warna merah) berlabel anti-human IgG ditambahkan dan diinkubasi.
- IgG anti-manusia berlabel florochrome akan berikatan dengan antibodi HLA penerima, yang terikat pada sel T donor.
Flow cytometer menghitung jumlah sel T (warna merah dan hijau) dan sel T (warna hijau) dan membuat histogram.
Pencocokan Silang untuk Autoantibodi terhadap Limfosit:
Selama pencocokan silang, autoantibodi terhadap limfosit dalam serum penerima dapat berikatan secara tidak spesifik dengan limfosit donor dan memberikan hasil pencocokan silang positif palsu; dan akibatnya, pendonor secara keliru didiskualifikasi dari mendonorkan organ kepada penerima tertentu. Autoantibodi juga dapat menutupi keberadaan antibodi anti-donor spesifik.
Kehadiran autoantibodi terhadap limfosit dideteksi oleh pencocokan silang otomatis, di mana limfosit dan serum penerima digabungkan dalam uji sitotoksisitas standar. Pencocokan silang autoantibodi secara rutin dilakukan bersamaan dengan semua pencocokan silang donor hidup untuk setiap serum yang diuji.
Metode Biologi Molekuler untuk Pengetikan HLA:
Sebagian besar metode pengetikan molekuler menggunakan teknik reaksi berantai polimerase (PCR) untuk memperkuat secara selektif segmen gen HLA yang diperlukan untuk pengetikan.
Pengetikan Urutan Spesifik Priming (SSP):
DNA individu diekstraksi dari sel atau jaringan
sebuah†”
DNA ditambahkan ke tabung yang berisi set primer yang berbeda untuk gen HLA yang berbeda. Satu set primer tambahan disertakan sebagai kontrol amplifikasi positif di semua tabung.
`↓
Komponen lain dari reaksi PCR (seperti nukleotida DNA, DNA polimerase, buffer) ditambahkan dan siklus termal dilakukan.
sebuah†”
Produk yang diperkuat dielektroforesis dalam gel dengan etidium bromida dan difoto di bawah sinar UV.
saya. Kehadiran pita menunjukkan bahwa sampel DNA memiliki urutan yang sesuai dengan tipe HLA tertentu.
- Tidak adanya pita menunjukkan bahwa sampel DNA tidak mengandung urutan tertentu dari tipe HLA.
aku aku aku. Pita kontrol amplifikasi internal harus ada untuk interpretasi.
Kumpulan primer untuk pengetikan HLA tersedia secara komersial.
saya. Untuk pengetikan HLA-A, B, dan C diperlukan sekitar 100-200 reaksi.
- Untuk pengetikan HLA-DRB diperlukan sekitar 20-30 reaksi.
Hibridisasi Probe Oligonukleotida Urutan-spesifik (SSOP):
Metode SSOP melibatkan amplifikasi selektif target HLA diikuti dengan hibridisasi ke panel probe oligonukleotida. Ada dua format SSOP.
saya. Dot atau slot blot:
DNA yang diamplifikasi terikat pada penyangga padat (seperti membran nilon) dan probe hibridisasi berada dalam larutan.
- Membalikkan dot atau slot blot:
Probe terikat pada penyangga padat dan hibridisasi ke DNA yang diamplifikasi dalam larutan.
