Poin-poin berikut menyoroti tiga langkah berurutan teratas dari reaksi berantai polimerase (PCR). Langkah-langkah berurutannya adalah: Denaturasi 2. Annealing 3. Perpanjangan DNA.
Langkah Berurutan # 1. Denaturasi:
Langkah pertama adalah mendenaturasi DNA (DNA Primer dan DNA Asli). Pemisahan dua untai DNA dikenal sebagai denaturasi sementara penyatuan dua untai DNA disebut re-annealing atau hibridisasi (Gambar 48.1). Penemuan denaturasi dan anil ulang DNA dilakukan secara artifisial oleh Marmor dan Lane (1960).
Menurut mereka, DNA untai ganda dapat dipisahkan menjadi dua untai tunggal yang terpisah (denaturasi) dengan pemanasan pada suhu tinggi (90-95 °C) dan hibridisasi atau penggabungan dua untai DNA (DNA untai ganda) yang memungkinkan. dengan menurunkan suhu (50-56 °C).
Ini adalah prinsip utama di mana PCR berfungsi. Prinsip kedua adalah perpanjangan primer dengan bantuan enzim DNA polimerase.
DNA asli, primer dan enzim polimerase DNA (Tag polimerase) ditambahkan dalam tabung PCR dan suhu dinaikkan dan diturunkan dalam mesin PCR untuk denaturasi dan hibridisasi.
Langkah Berurutan # 2. Anil:
Setelah mendenaturasi DNA, langkah selanjutnya adalah membiarkan primer sintesis menempel pada untaian DNA yang berlawanan dari urutan target yang diinginkan. Annealing (hibridisasi) dapat terjadi jika suhu dari 95 °C diturunkan menjadi 50/56 °C. Suhu kemudian diturunkan di dalam mesin.
Segera setelah suhu diturunkan, untaian DNA asli tidak hanya akan mengikat satu sama lain tetapi juga mengikat primer. Hibridisasi spesifik ini, atau “rekombinasi” nukleotida komplementer, memberikan dasar pemikiran dan praktis untuk sebagian besar DNA rekombinan (Gambar 48.2).
Langkah Sekuensial # 3. Perpanjangan DNA (diperlukan Enzim Taq Polymerase):
Setelah primer dianil, primer harus diperpanjang menggunakan primer oligonukleotida sebagai titik inisiasi. menjelaskan bahwa enzim DNA polimerase diperlukan untuk sintesis DNA. Oleh karena itu, untuk perpanjangan primer diperlukan DNA polimerase yang termostabil agar enzim tidak rusak pada suhu tinggi.
Polimerase termostabil (Taq polimerase) diisolasi dari Thermus aquaticus. Taq polimerase memiliki keunggulan luar biasa dalam melakukan reaksi PCR. Ini memiliki suhu aktivitas optimal sekitar 70 °C dan enzim segar tidak ditambahkan ke setiap tabung reaksi setelah proses pemanasan dan pendinginan.
DNA polimerase termostabil sekarang diproduksi oleh perusahaan yang berbeda dengan sumber yang berbeda (selain Thermus aquaticus) dengan nama dagang (TM) yang berbeda. Untuk perpanjangan primer, DNA polimerase termostabil ditambahkan ke dalam tabung dan suhunya kemudian dinaikkan menjadi 65-70 °C.
Siklus selanjutnya pemisahan untai (denaturasi), hibridisasi primer (anil), dan sintesis untai (ekstensi) memastikan amplifikasi eksponensial dari urutan target dengan menggunakan urutan yang diperkuat jika siklus sebelumnya sebagai templat baru, ada tiga siklus (Gbr. 48.2). ).
Pembuatan Primer:
Primer adalah urutan pendek (sering RNA) digunakan untuk membuat dua nukleotida, disebut primer, dengan satu untuk setiap ujung fragmen DNA dan menyediakan ujung 3 -OH bebas di mana DNA polimerase memulai sintesis rantai deoksiribonukleotida.
Satu urutan dibuat dalam arah indra, sementara urutan lainnya dibuat dalam arah anti-indra. (Gbr. 48.2). Primer digunakan untuk mengunggulkan sintesis untaian DNA komplementer dan dirancang sedemikian rupa sehingga DNA di antara primer adalah fragmen yang diinginkan untuk diamplifikasi.
Jika messenger RNA (mRNA) diamplifikasi, ia harus diubah menjadi DNA komplementer (cDNA) oleh DNA polimerase yang bergantung pada RNA, reverse transcriptase. Kompleks cDNA kemudian diubah menjadi DNA beruntai ganda, menjadi cetakan untuk reaksi PCR selanjutnya.
Ini sering dikenal sebagai reaksi rantai transkriptase polimerase terbalik (RT PCR). Primer dapat dihasilkan secara artifisial atau dapat dibeli dari perusahaan.
Setelah reaksi selesai, produk yang diamplifikasi (DNA) dapat divisualisasikan dengan elektroforesis gel. Sifat fisik penting dari molekul DNA adalah bahwa setiap nukleotida individu memiliki muatan negatif bersih yang dihasilkan dari gugus fosfat.
Jadi fragmen dengan ukuran berbeda yang terpapar medan listrik cenderung bermigrasi ke arah elektroda positif dengan kecepatan berbeda tergantung pada ukurannya, dengan fragmen kecil bermigrasi lebih cepat daripada yang lebih besar. Proses pemisahan berdasarkan muatan listrik ini disebut elektroforesis.
Sampel DNA, setelah dicerna menjadi fragmen dengan ukuran berbeda oleh enzim restriksi (endonuklease), ditambahkan ke media pendukung seperti gel agrosa atau akrilamida. Pori-pori gel bergantung pada persentasenya dan dapat dibandingkan dengan saringan (molekul). Dengan demikian, kecepatan migrasi fragmen DNA melalui gel bergantung pada ukuran fragmen DNA dan voltase yang diberikan.
Prosedur untuk memisahkan dan memotong fragmen DNA spesifik adalah Southern blotting. Pentingnya teknik ini adalah bahwa fragmen untai tunggal dapat dipindahkan dengan aksi kapiler ke media pendukung padat (Nylon atau membran selulosa) dan difiksasi secara permanen dengan pemanasan (Gbr. 48.3).
Setelah elektroforesis, pola DNA dapat divisualisasikan di bawah lampu UV setelah diberi pewarnaan etidium bromida; etidium bromida adalah pewarna fluoresen. Elektroforesis gel agrose membedakan fragmen dari 100 pasangan basa hingga 60000 pasangan basa (60 kb), sedangkan gel poliakrilamida secara efektif memisahkan fragmen dari 1000 pasangan basa (1 kb).
Pulse gel electrophoresis (PFGE) memungkinkan pemisahan fragmen DNA bahkan hingga 2kb. Dalam prosedur ini medan listrik diubah dalam arah yang berbeda memaksa molekul DNA untuk reorientasi antara setiap pulsa, atau arus listrik. Ini adalah teknik terbaik untuk mengidentifikasi gen yang dikenal.
Endonuklease dapat mengenali 3,4,5,6 atau 8 pasangan basa dan tersedia di pasar.
buffer/garam PCR.
Untuk Taq DNA polimerase, buffer dibuat seperti di bawah ini:
50mM KCI
10 mM Tris-HCI pada suhu kamar
Dimetil sulfoksida (DMSO) dan glikol digunakan sebagai pelarut bersama dalam buffer PCR ketika target memiliki suhu denaturasi yang sangat tinggi.
Deoxynucleotide triphosphate (dNTPs) adalah kofaktor ion.
Sekarang perusahaan bioteknologi menyediakan solusi yang sudah disiapkan.
Prinsip dasarnya dijelaskan sebagai berikut:
Ada empat dNTP yaitu, dATP (adenine triphosphate), dCTP (cytosine), dGTP (gunine), dUTP (uracil) yang digunakan sesuai dengan aturan pasangan basa untuk memperpanjang primer dan akhirnya menyalin urutan target.
DNTP berikatan dengan Mg 2+ . Jumlah dNTP yang ada dalam suatu reaksi akan menentukan jumlah Mg 2+ bebas yang tersedia untuk aktivitas enzim yang optimal. Larutan stok dNTP harus dinetralkan dengan basa Tris hingga pH 7,0 dan konsentrasinya harus ditentukan secara spektrofotometri.
Analog Substrat dan Substrat:
Taq polimerase bekerja (dNTP) sangat efektif. Namun, ada beberapa substrat termodifikasi yang tersedia sebagai pengganti substrat Tag DNA polimerase. Mereka adalah dogoxigenin-dNTP, biotin-11-dUTP, C7deaza-dGTP, dan dNTPS berlabel fluoresen.
Jenis PCR berikut ini digunakan secara umum:
(1) PCR bersarang;
(2) RT-PCR;
(3) Jangkar PCR;
(4) PCR asimetris;
(5) PCR terbalik;
(6) DOP-PCR.
