Tujuan:
Semua bakteri tetap dalam ‘bentuk vegetatif’ mereka, jika kondisi lingkungan mendukung aktivitas metabolisme normal mereka.
Dalam bentuk ini, mereka mengambil nutrisi, tumbuh dan berkembang biak.
Di sisi lain, sebagian besar dari mereka mati, ketika kondisi lingkungan menjadi tidak menguntungkan, seperti cuaca dingin yang parah, panas yang ekstrim, penuaan, kekurangan nutrisi, paparan radiasi dan bahan kimia beracun.
Namun, beberapa spesies bakteri, dapat bertahan hidup dalam kondisi buruk seperti itu dengan mengubah diri mereka menjadi bentuk yang sangat tahan dan tidak aktif secara metabolik yang disebut ‘spora’. Dalam kondisi buruk, spora diproduksi di dalam sel vegetatif melalui dehidrasi dan kontraksi isi selnya.
Spora ini, terbentuk di dalam sel bakteri, disebut ‘endospora’ (Gambar 2.13). Jika kondisi buruk memburuk, sel pecah, melepaskan endospora, yang sekarang menjadi sel dorman independen yang disebut ‘spora’.
Proses pembentukan spora disebut ‘sporogenesis’. Spora memiliki lapisan yang tebal dan relatif kedap air, seperti korteks spora dan mantel spora, yang melindungi sel dari kerusakan fisik. Spora mendapatkan perlawanannya melalui beberapa mekanisme, yang belum dijelaskan dengan jelas.
Ketika kondisi menjadi menguntungkan, lapisan yang menutupi spora pecah dan spora memunculkan sel vegetatif yang aktif secara metabolik. Proses ini disebut ‘perkecambahan’.
Dengan demikian, berdasarkan kemampuannya membentuk spora, bakteri dapat dibedakan menjadi dua kelompok sebagai berikut:
(1) Bakteri Pembentuk Spora (Spore-formers):
Bakteri yang dapat menghasilkan spora untuk bertahan hidup pada kondisi lingkungan yang buruk adalah bakteri pembentuk spora (spore-former). Sebagian besar, tiga genera bakteri berbentuk batang berikut ini dapat menghasilkan spora dalam kondisi lingkungan yang buruk.
- Bakteri berbentuk batang aerobik
- Bacillus spp.
- Bakteri berbentuk batang anaerobik
- Clostridium spp.
3.Desulfotomaculum spp.
(2) Bakteri Pembentuk Bukan Spora (Non-spore-formers):
Bakteri, yang tidak dapat menghasilkan spora dan karena itu, mati dalam bentuk vegetatifnya di bawah kondisi lingkungan yang merugikan, adalah bakteri pembentuk non-spora (pembentuk non-spora).
Pewarnaan spora bertujuan untuk membedakan spora dan sel vegetatif pembentuk spora dan membedakan pembentuk spora dari pembentuk bukan spora. Pewarnaan spora juga membantu dalam identifikasi bakteri yang termasuk dalam genera Bacillus, Clostridium dan Desulfotomaculum.
Prinsip:
Spora berbeda dengan sel vegetatif karena memiliki lapisan yang tebal dan relatif kedap air di sekelilingnya (Gambar 2.14). Pewarna primer, malachite green, tidak dapat menembus spora melalui lapisan ini.
Oleh karena itu, penetrasi noda primer ditambah dengan penerapan panas, yang mendorongnya melalui lapisan penutup ke dalam protoplas spora. Sekarang, spora tampak hijau. Ketika spora diperlakukan dengan agen penghilang warna, air ledeng, mereka tidak mengalami penghilangan warna, karena tidak mengandung air.
Air keran hanya menghilangkan noda primer berlebih yang ada di sekitar spora. Dengan demikian, spora mempertahankan warna hijau. Selanjutnya, ketika diwarnai dengan safranin, molekul safranin tidak dapat masuk ke dalam spora melalui lapisan penutup. Dengan demikian, akhirnya spora mempertahankan warna hijau noda primer dan tampak hijau.
Di sisi lain, sel-sel bakteri vegetatif dengan mudah mengambil noda primer, hijau perunggu, tetapi noda tidak memiliki afinitas yang kuat untuk komponen sel vegetatif, karena itu akan terhanyut, ketika dihilangkan warnanya di bawah air ledeng.
Sekarang, sel-sel vegetatif tampak tidak berwarna. Ketika diwarnai dengan safranin, sel vegetatif yang tidak berwarna mengambil noda dan tampak merah tidak seperti spora, yang tampak hijau.
Bahan yang Dibutuhkan:
Slide, loop, malachite green, safranin, bakteri pembentuk spora, hot plate, mikroskop, minyak imersi.
Prosedur:
- Sebuah slide dibersihkan dengan benar di bawah air ledeng, sehingga air tidak tertinggal sebagai tetesan di permukaannya.
- Air yang menempel diseka dengan kertas bibulous dan slide dikeringkan dengan udara.
- Apusan bakteri pembentuk spora dibuat di tengah kaca objek dengan dua cara seperti di bawah ini.
(sebuah) Jika pembentuk spora tumbuh pada lempeng agar atau agar miring akan diamati, setetes air ditempatkan di tengah slide. Sebuah loop disterilkan di atas api dan loop bakteri Clostridium dari piring tua atau kultur miring (berusia 48-72 jam) dari pembentuk spora, seperti Clostridium supergenes atau Bacillus subtilis dipindahkan ke tetesan air.
Kemudian, dengan putaran lembut gelung pada tetesan air, suspensi bakteri dibuat dan tetesan disebarkan sampai apusan diperoleh. Seiring bertambahnya usia bakteri pembentuk spora di piring atau biakan miring, mereka membentuk spora.
(b) Jika pembentuk spora tumbuh dalam kaldu cair akan diamati, kultur kaldu, yang hanya mengandung sel vegetatif, mengalami tekanan panas, dengan memanaskan pada penangas air selama 15 menit, sehingga beberapa sel vegetatif membentuk spora untuk mengatasi stres panas. Setetes suspensi sel spora-vegetatif campuran dari kultur kaldu ditempatkan langsung di tengah slide dengan loop steril dan apusan dibuat dengan menyebarkan.
- Apusan dikeringkan dengan udara.
- Apusan difiksasi dengan pemanasan. Pemanasan menghasilkan koagulasi protein seluler, sehingga sel menempel pada permukaan slide dan tidak hanyut selama pewarnaan. Fiksasi panas dilakukan dengan melewatkan slide secara cepat di atas nyala api 2-3 kali, dengan apusan. permukaan menghadap ke atas, sehingga apusan tidak memanas.
- Apusan dibanjiri dengan noda primer, hijau perunggu.
- Slide disimpan di atas hot plate yang hangat dan preparat dibiarkan menguap selama 2-3 menit. Suhu hot plate diatur sedemikian rupa sehingga sediaan tidak mendidih dan cepat menguap. Kehilangan penguapan diisi kembali, sehingga apusan tidak mengering.
- Slide dikeluarkan dari hot plate dan didinginkan.
- Apusan dihilangkan warnanya dengan mencuci di bawah air keran yang mengalir lembut, sedemikian rupa sehingga air tidak langsung jatuh ke atas apusan.
- Smear dibanjiri dengan counter-stain, safranin, selama 30 detik.
- Noda kontra yang berlebihan dibersihkan sepenuhnya dari apusan di bawah air keran yang mengalir dengan lembut, sedemikian rupa sehingga air tidak jatuh langsung ke apusan.
- Slide dikeringkan dengan kertas bibulous.
- Slide dijepitkan ke panggung mikroskop dan apusan diamati dengan daya rendah dan objektif kering tinggi.
- Setetes minyak imersi dioleskan pada apusan.
- Apusan diamati dengan objektif imersi minyak.
Pengamatan (Di bawah tujuan perendaman minyak):
- Warna sel:
Hijau : Spora (Perhatikan letak spora)
Merah: Sel vegetatif
- Bentuk bakteri:
Bulat (coccus)
Berbentuk batang (basil)
Seperti koma (vibrio)
Spiral (spirocheta)
- Susunan bakteri:
Berpasangan (diplobacillus / diplococcus)
Dalam empat (tetrad)
Berantai (streptococcus/streptobacillus)
Cluster seperti anggur (staphylococcus)
Kuboid (sarcinae atau oktet)
- Ukuran bakteri:
Dengan perkiraan mata, buatlah gambar bidang di bawah tujuan perendaman minyak.
