Baca artikel ini untuk mempelajari tentang uji oksidase pada Bakteri untuk Mengetahui Kemampuannya Mengoksidasi Sitokrom C Tereduksi:
Prinsip:
Beberapa bakteri memiliki kemampuan untuk mengoksidasi ‘sitokrom C tereduksi’ yang ada dalam selnya menjadi ‘sitokrom C teroksidasi’, karena mereka dapat menghasilkan enzim ‘sitokrom oksidase’.
Sitokrom C yang teroksidasi menghasilkan warna ungu (ungu Wurster) dengan pewarna N-tetramethyl-para-phenylenediamine (yaitu reagen oksidase).
Pada uji oksidase, plat agar nutrien yang mengandung koloni bakteri uji dibanjiri larutan reagen oksidase. Jika bakteri memiliki kemampuan untuk menghasilkan enzim sitokrom oksidase, warna koloni pada cawan akan berubah menjadi ungu. Jika bakteri tidak memiliki kemampuan untuk menghasilkan sitokrom oksidase, koloni mempertahankan warna merah muda asli dari pereaksi oksidase.
Bahan yang Dibutuhkan:
Cawan petri, labu berbentuk kerucut, sumbat kapas, loop inokulasi kawat platinum, autoklaf, pembakar bunsen, ruang aliran laminar, tabung pembuangan, inkubator, strip kertas saring Whatman, reagen oksidase (N- tetramethyl-para-phenylenediamine) agar nutrisi, koloni terisolasi atau kultur murni bakteri.
Prosedur:
(a) Metode Pelat:
- Dua cawan petri dibersihkan, ditutup dengan kertas kerajinan dan diikat dengan benang atau karet gelang (Gambar 7.19). Langkah-langkah ini serta sterilisasi cawan petri pada langkah 6 dihilangkan, jika cawan petri yang disterilkan dengan oven digunakan secara langsung.
- Bahan media nutrien agar atau bubuk siap pakai yang diperlukan sebanyak 100 ml media ditimbang dan dilarutkan dalam 100 ml air suling dalam labu berbentuk kerucut 250 ml dengan cara dikocok dan diaduk.
- Ditentukan pH-nya menggunakan kertas pH atau pH meter dan diatur menjadi 7,0 menggunakan HCI 0,1N jika lebih banyak atau menggunakan NaOH 0,1N jika lebih sedikit.
- Labu dipanaskan untuk melarutkan agar-agar dalam media secara sempurna.
- Labu ditutup dengan kapas, ditutup dengan kertas kerajinan dan diikat dengan benang atau karet gelang.
- Dua cawan petri dan labu berbentuk kerucut berisi media agar nutrisi disterilkan pada suhu 121°C (tekanan 15 psi) selama 15 menit dalam autoklaf.
- Setelah sterilisasi, dikeluarkan dari autoklaf dan dibiarkan dingin beberapa saat, tanpa membiarkan media mengeras. Pendinginan medium mencegah kondensasi dan akumulasi tetesan air di dalam pelat. Jika media telah disiapkan dan dipadatkan selama penyimpanan, maka harus dicairkan dengan cara dipanaskan secara hati-hati sampai benar-benar meleleh.
- Untuk menyiapkan cawan agar nutrien, sebelum media agar nutrien yang disterilkan mendingin dan memadat, dalam kondisi cair yang hangat, dituangkan secara aseptik, sebaiknya di dalam ruang aliran laminar, ke dalam dua cawan petri yang disterilkan (masing-masing sekitar 20 ml), sehingga media cair menutupi bagian bawah cawan petri sepenuhnya.
Kemudian, pelat ditutup dengan tutupnya dan dibiarkan dingin, untuk memadatkan media di dalamnya. Uap air yang mungkin mengembun pada permukaan bagian dalam pelat dan tutup diuapkan dengan menjaga pelat dan tutup dalam posisi terbalik di dalam inkubator pada suhu 37°C selama kurang lebih 1 jam.
- Setiap lempeng diberi tanda di sisi bawah menjadi empat bagian.
- “Spot inoculation” dari bakteri uji dilakukan secara aseptis, sebaiknya dalam ruang aliran laminar, di tengah setiap kuartal dengan membuat noda (atau apusan kecil) bakteri dengan bantuan loop yang disterilkan dengan api. Loop disterilkan setelah setiap inokulasi.
- Pelat yang telah diinokulasi diinkubasi dengan posisi terbalik, atas ke bawah, pada suhu 37°C selama 24 jam dalam inkubator hingga terlihat koloni bakteri.
- Pelat dibanjiri dengan reagen oksidase.
(b) Metode Kertas:
- Strip kertas saring Whatman, dicelupkan ke dalam reagen oksidase 1%, dikeringkan dan disimpan dalam kegelapan.
- Sebelum digunakan, itu dibasahi dan loop bakteri uji diletakkan di atasnya sebagai tempat dengan bantuan loop kawat platinum. Nichrome loop dapat mengoksidasi reagen. Oleh karena itu, platinum loop harus digunakan.
- Bintik diamati setelah 10 detik.
Pengamatan:
(a) Metode Pelat:
- Warna ungu berkembang pada koloni bakteri: Oksidase positif.
- Warna ungu tidak berkembang pada koloni
(Warna merah muda dari reagen oksidase dipertahankan): Oksidase negatif.
(b) Metode Kertas:
- Warna ungu berkembang di tempat: Oksidase positif.
- Warna ungu tidak berkembang di tempat: Oksidase negatif.
