Kondisi yang Diperlukan untuk Kultur Jaringan Tanaman

Ada beberapa aspek penting dari kultur jaringan. Ini adalah: (A) Kondisi aseptik, (B) Aerasi, (C) Peralatan, dan (D) Media nutrisi!

Kultur jaringan adalah metode kultur ‘in vitro’ sel tanaman atau hewan, jaringan atau organ pada media nutrisi dalam kondisi aseptik biasanya dalam wadah kaca. Kultur jaringan terkadang disebut sebagai kultur ‘steril’ atau ‘in vitro’.

Beberapa jenis organ tanaman dapat ditumbuhkan dalam kultur steril antara lain akar, pucuk pucuk (apical meristem culture), daun, bagian bunga dan buah. Persyaratan nutrisi untuk kultur organ tersebut sangat bervariasi dari spesies ke spesies dan menurut jenis organ yang bersangkutan, tetapi persyaratan umum tertentu dapat dikenali. Ahli botani Jerman Gottleib Haberlandt pertama kali mencoba membiakkan jaringan tanaman ‘in vitro’. Ia memulai pekerjaannya pada tahun 1898. Ia menggunakan sel-sel dari jaringan palisade daun, sel-sel dari empulur, epidermis dan rambut epidermis dari berbagai tanaman untuk kultur dalam media yang mengandung larutan Knop, aspergin, pepton dan sukrosa.

Kondisi yang Diperlukan untuk Kultur Jaringan Tumbuhan:

Ada beberapa aspek penting dari kultur jaringan. Ini adalah: (A) Kondisi aseptik, (B) Aerasi, (C) Peralatan, dan (D) Media nutrisi.

A. Kondisi aseptik:

Kultur jaringan harus dilakukan dalam kondisi aseptik sepenuhnya. Panas kering digunakan untuk mensterilkan peralatan dalam inkubator. Sterilisasi panas basah dilakukan dalam autoklaf pada suhu 120°C dengan tekanan 15 lb selama 15 menit. Media cair, yang tidak stabil pada suhu tinggi disterilkan dengan ultrafiltrasi. Bahan kimia, seperti alkohol digunakan untuk mensterilkan area kerja dan instrumen.

Jaringan yang akan dibiakkan disterilkan permukaannya secara kimiawi, beberapa bahan pensteril yang biasa digunakan adalah:

(a) 9-10% kalsium hipoklorit, (b) larutan natrium hipoklorit 2%, (c) 10-12% hidrogen peroksida, (d) 1-2% air bromin. Beberapa agen sterilisasi lainnya adalah: air klorin 1%, merkuri klorida, perak nitrat, antibiotik dll.

(b) Aerasi:

Aerasi yang tepat dari jaringan dalam media kultur sangat penting. Jaringan tersebut, yang dibiakkan pada media semi-padat tidak memerlukan metode khusus untuk aerasi. Tetapi jaringan yang dibiakkan dalam media cair memerlukan alat khusus untuk aerasi.

(c) Peralatan:

Gelas yang digunakan untuk kultur jaringan harus dari kaca borosilikat (kaca Pyrex), karena kaca soda dapat menghambat pertumbuhan jaringan.

(d) Media nutrisi:

Media nutrisi yang dibutuhkan untuk kultur bervariasi dengan jenis tanaman dan tujuan produksi kultur. Sebagian besar media mengandung beberapa garam anorganik dari unsur mayor dan minor, vitamin dan sukrosa. Media seperti itu disebut media basal. PH media kultur dipertahankan antara 5,6 – 5,8. Jika diperlukan media dipadatkan dengan 0,5 – 1% agar. Zat anorganik – Nitrogen biasanya ditambahkan dalam bentuk garam nitrat atau amonium.

Kalium ditambahkan sebagai KC1 atau KNO ₃ atau KH ₂ PO ₄ . Kalsium ditambahkan dalam bentuk CaCl ₂ .2H ₂ O atau Ca (NO ₃ ) ₂ .4H ₂ O. Magnesium dan belerang ditambahkan dalam bentuk magnesium sulfat (MgS0 ₄ .7H ₂ 0). Fosfor diperoleh dari NaH ₂ PO ₄ .H ₂ O. Zat organik -2 – 4% sukrosa biasanya digunakan dalam suatu media. Vitamin biasanya dibutuhkan dalam jumlah kecil. Tiamin ditambahkan sebagai timin hidroklorida. Asam nikotinat (0,5 mg/1), tiamin (0,1-1 mg/1) dan piridoksin (0,5 mg/1) biasanya ditambahkan ke media. Kebanyakan kultur kalus memerlukan suplai hormon seperti auksin (IAA, NAA dan 2-4-D) dan Sitokinin (Zeatin, Kinetin dan benzil adenin). Giberelin biasanya tidak diperlukan, tetapi diperlukan untuk kultur meristem apikal. Etilen membantu diferensiasi elemen trakea.

Untuk berbagai jenis budaya berbagai jenis media budaya dapat digunakan. Beberapa media kultur yang banyak digunakan adalah – media White, media Murashige dan Skoog, media Nitsch, media Nagata dan Takebe, dll.

Budaya Akar – Kotte dan Robbins:

(1922) pertama kali berhasil membudidayakan pucuk akar gandum dalam waktu singkat. Pada tahun 1934 White pertama kali berhasil membudidayakan akar tomat untuk waktu yang tidak terbatas dalam media yang mengandung garam mineral, gula dan ekstrak ragi. Akar biasanya ditanam dalam media cair. Untuk kultur akar, beberapa modifikasi media White terbukti bermanfaat. Daripada Fe(S0 ₄ ) ₃ sebagai sumber besi, lebih baik menggunakan besi khelat dalam bentuk NaFeEDTA. Konsentrasi gula 1,5-2% sudah cukup. Kebutuhan vitamin bervariasi menurut tanaman. Akar sereal membutuhkan lebih banyak auksin daripada akar dikotil.

Sebagai aturan, potongan akar dari sebagian besar spesies hanya menghasilkan jaringan akar dalam kultur. Ada pengecualian, bagaimanapun, di mana mereka meregenerasi tunas tunas serta akar lebih lanjut misalnya, Convolvulus, Taraxacum dan Rumex

Signifikansi Budaya Akar:

1. Dari kultur akar, banyak akar yang seragam secara genetik dihasilkan dalam beberapa hari. Ini disebut ‘klon akar terisolasi’.
2. Dari biakan kontinyu akar yang diisolasi, kebutuhan nutrisi akar dapat dipelajari.
3. Kultur akar juga cocok untuk penyelidikan akar lateral dan pembentukan tunas, inisiasi aktivitas kambium dan nodulasi.

Budaya pucuk pucuk dan daun:

Seperti akar, meristem apikal pucuk terisolasi dan primordia daun juga dapat ditanam dalam kultur steril. Ini sering disukai karena ini sering menghasilkan akar dan karenanya akhirnya berkembang menjadi tanaman lengkap. Media Murashige dan Skoog biasanya digunakan untuk kultur pucuk.

Daun muda pakis (Osmunda cinnamomea, bunga matahari (Helianthus annus) dan tembakau (Nicotiana tabacum) yang diisolasi telah berhasil ditanam pada media sederhana yang hanya mengandung sukrosa dan garam anorganik.

Signifikansi Budidaya Pucuk Pucuk:

1. Dengan kultur meristem apikal, klon bebas patogen dapat diproduksi dengan sangat cepat
2. Kultur ujung pucuk merupakan metode yang sangat penting untuk perbanyakan vegetatif dan digunakan pada anggrek, dimana perbanyakan vegetatif sangat lambat.

Kultur Bunga, Ovarium dan Ovula:

Bunga Angiospermae pertama kali dibudidayakan oleh Larue (1942). Bunga lengkap dari beberapa dikotil berhasil dibudidayakan oleh Nitsch (1951). Dalam budaya, bunga seperti itu menghasilkan buah. Buah yang lebih besar diperoleh pada media yang dilengkapi dengan hormon seperti IAA, giberelin, sitokinin. Bunga dipotong sebelum penyerbukan tidak dapat menghasilkan buah.

Nitsch (1951) berhasil mengkultur potongan embrio beberapa tanaman, seperti Lycopersicon esculentum, Nicotiana tabacum, Phaseolus vulgaris, Cucumis anguria, Fragaria sps. dll. Indung telur Cucumis dan Lycopersicon yang dipotong menghasilkan buah dengan biji yang layak pada kultur. Tapi buah ini lebih kecil dari biasanya.

Signifikansi Kultur Ovarium:

1. Dengan kultur ovarium, haploid dapat diproduksi. Ovarium Hordeum vulgare, Nicotiana tabacum dan Triticum aestivum yang tidak dibuahi berkembang menjadi haploid.
2. Masa dormansi benih dapat dikurangi dengan kultur ovarium.
3. Hibrida langka juga dapat diproduksi pada kultur ovarium.

Kultur ovula pada atau setelah tahap globular menghasilkan biji yang matang dengan mudah. Hal ini telah dicatat pada beberapa tanaman seperti Allium cepa, Gynandropsis, lmpatiens dan Nicotiana tabacum, dll. Ovula dipotong segera setelah pembuahan sebelum mencapai bentuk bulat, biasanya gagal menghasilkan biji yang matang pada kultur. Ovul seperti itu membutuhkan media khusus untuk pertumbuhan yang tepat. Signifikansi Kultur Ovula

1. Zigot atau embrio yang sangat muda yang tidak dapat dikultur dengan mudah dapat ditumbuhkan dengan kultur ovula.
2. Tahap perkembangan zigot atau embrio muda dapat dipelajari dalam kultur ovula.
3. Kebutuhan nutrisi embrio muda dapat dipelajari.
4. Pada beberapa persilangan interspesifik di mana kultur embrio gagal menghasilkan bibit, kultur ovula mungkin merupakan metode yang efektif untuk menghasilkan bibit yang layak.

Budaya Embrio:

Metode pembiakan embrio yang dipotong dari benih pada media kultur yang disterilkan disebut kultur embrio.

Haning (1904) bekerja dengan Raphanus dan Cochlearia (Brassicaceae) pertama berhasil mengkultur embrio in vitro. Laibach (1925, 1929) berhasil menerapkan teknik kultur embrio untuk membesarkan tanaman dari benih hibrida yang sangat tipis dan sangat menyusut, yang biasanya gagal berkecambah. Kebutuhan nutrisi embrio yang tumbuh secara bertahap menurun dan kapasitas biosintetiknya meningkat secara bertahap. Jadi komposisi media kultur tergantung pada tahap embrio yang akan dikultur.

Untuk pembiakan embrio muda (fase heteromorfik) media anorganik yang dilengkapi dengan zat organik seperti ekstrak ragi, ekstrak malt, gula, dll., sudah cukup. Lebih mudah untuk membiakkan embrio yang berdiferensiasi. Embrio tersebut dapat tumbuh pada media kultur yang hanya mengandung beberapa garam mineral dan sukrosa, karena mereka dapat mensintesis sebagian besar zat yang dibutuhkan untuk pertumbuhannya. Embrio globular atau post-globular dibiakkan pada media yang ditambah dengan santan, ekstrak ragi atau kasing dalam hidrolisat atau hormon pertumbuhan.

Signifikansi Kultur Embrio:

1. Ini adalah metode par excellence untuk memahami kebutuhan nutrisi embrio yang sedang berkembang.
2. Melalui kultur embrio dapat diketahui faktor-faktor yang mengendalikan diferensiasi embrio.
3. Ini menawarkan sarana untuk mencapai kombinasi hibrida yang jauh lebih luas yang telah ­dimungkinkan hingga saat ini. Kombinasi ini memiliki nilai ekonomi potensial di bidang pertanian, hortikultura dan kehutanan.
4. Dengan kultur embrio masa dormansi benih dapat dipersingkat.
5. Perbanyakan tanaman langka, haploid dan pengenalan karakter ketahanan penyakit adalah manfaat penting lainnya dari kultur embrio.

Kultur Anther dan Pollen:

Kultur serbuk sari pertama yang berhasil didirikan oleh Tulecke pada tahun 1953 menggunakan serbuk sari dewasa dari Ginkgo biloba. Namun, dia, serta yang lainnya, gagal membudidayakan serbuk sari angiospermae. Pada tahun 1966, Guha dan Maheshwari membudidayakan antera Datura innoxia pada media yang dilengkapi dengan kinetin, santan dan memperoleh embrioid haploid, yang tumbuh menjadi planlet. Metode ini kini berhasil diterapkan pada berbagai spesies tumbuhan, seperti Atropa, Brassica, Hordeum, Lycopersicon, Triticum, Zea, dll.

Telah diamati bahwa embrioid yang muncul langsung dari mikrospora melewati tahap globular, berbentuk hati, dan torpedo yang khas dari ontogeni embrio zigotik diploid normal sebelum akhirnya memanjang dan membentuk meristem pucuk dan akar. Pada beberapa tanaman lain, haploid tidak muncul langsung dari mikrospora tetapi melalui intervensi kalus.

Mikrospora mula-mula berkembang menjadi badan multiseluler yang kemudian menimbulkan kalus yang sangat padat. Subkultur kalus dalam embriogenesis – media penginduksi yang mengandung auksin konsentrasi spesifik dan sitokinin menyebabkan inisiasi bibit haploid.

Signifikansi Kultur Anther dan Pollen:

1. Kultur serbuk sari sangat penting dalam studi mutagenik
2. Dengan polen dan biakan polen banyak tanaman haploid dapat diproduksi dengan sangat cepat, oleh karena itu haploid dan turunannya yang homozigot menawarkan alat yang sangat berharga untuk pemuliaan tanaman dan pohon ­.
3. Tanaman diploid homozigot yang diperoleh dengan menggandakan kromosom haploid sangat penting dalam pemuliaan tanaman dan perbaikan tanaman.

Kultur Suspensi Sel:

Kultur suspensi sel adalah kultur sel atau agregat sel yang terdispersi dalam media cair yang bergerak. Kultur suspensi dari berbagai tanaman menunjukkan proporsi sel bebas dan agregat sel yang berbeda. Sel-sel kultur suspensi seringkali memiliki nuklei besar, sitoplasma padat, dan butiran pati. Sel menunjukkan habituasi hormon, peningkatan tingkat ploidi dan hilangnya totipotensi. Pemisahan sel tinggi dan periode penggandaan sel adalah 24-78 jam. Tetapi suspensi sel dari sumber yang berbeda sangat bervariasi dalam ekspresi karakteristik ini.

Kultur suspensi terutama terdiri dari dua jenis – kultur batch dan kultur kontinyu. Dalam sel kultur batch ditanam dalam volume media yang tetap. Ini adalah budaya sistem tertutup. Dalam pembiakan berkelanjutan dengan pemompaan, aliran media biakan yang konstan dipertahankan dalam bejana biakan. Pembentukan sel baru kurang lebih sama dengan jumlah sel lama yang hilang. Dengan demikian budaya dipertahankan dalam kondisi mantap. Kultur berkelanjutan dapat berupa tipe tertutup atau terbuka.

Kultur suspensi diperoleh dengan cara berikut:

1. Menempatkan potongan jaringan yang rapuh seperti kalus dalam media cair yang bergerak.
2. Memecah bibit atau embrio steril dalam homogenizer dan melakukan subkultur suspensi setelah sedimentasi.

Berbagai jenis pengocok dan pemintal mekanis digunakan untuk mengaduk media cair untuk mengamankan pemisahan sel. Jika diinginkan klon sel tunggal, suspensi dilapiskan pada pelat agar dalam cawan petri.

Signifikansi Budaya Suspensi Sel:

1. Kultur sel dapat digunakan di masa depan untuk sintesis keseluruhan atau sebagian produk tanaman sekunder seperti alkaloid, glikosida, dll.
2. Dengan kultur sel banyak masalah dalam botani terapan dapat dipecahkan.

Kultur Protoplas:

Klerker (1892) melakukan upaya yang gagal untuk mengisolasi protoplas. Pada tahun 1909 Kunster mengisolasi protoplas dengan metode mekanis. Teknik lanjutan kultur sel bebas melibatkan kultur protoplas terisolasi. Pada dasarnya, metode tersebut terdiri dari, pertama, memecah dinding sel secara mekanis atau kimia menggunakan enzim dan dengan demikian membebaskan protoplas yang kemudian dibiakkan seperti sel utuh menggunakan media kultur yang sesuai. Dengan kata lain, sel-sel tersebut dibuat telanjang dan kemudian dibiakkan.

Media Murashige dan Skoog yang dilengkapi dengan auksin dan sitokinin membantu pertumbuhan protoplas. Penambahan manitol 13% ke dalam media mencegah lisis osmotik dari protoplas yang diisolasi. Agar 1,5% dapat ditambahkan ke media.

Takebe dan Rekan kerja (1971) memperoleh seluruh tanaman dari protoplas hibrida tembakau. PS Rao (1984) memperoleh tumbuhan lengkap dengan mengkulturkan protoplas yang diisolasi dari jaringan pohon cendana (album Santalum)

Signifikansi Kultur Protoplas:

1. Dari protoplas yang diisolasi, tanaman hibrida dapat dihasilkan melalui fusi protoplas. Bahkan hibrida tersebut, yang tidak dapat diproduksi dengan prosedur normal karena ketidakcocokan seksual atau fisik ­, dapat diproduksi dengan fusi sel somatik.
2. Protoplas terisolasi diperlukan untuk percobaan fusi protoplas membentuk homokaryon dan heterokaryon.
3. Dari sel-sel mutan protoplas yang terisolasi dapat dipilih dan perbanyakan klon dapat dilakukan.
4. Salah satu masalah transformasi genetik adalah dinding sel yang berfungsi sebagai penghalang efektif untuk memasukkan DNA eksogen secara artifisial ke dalam sel. Kesulitan dihilangkan dengan isolasi protoplas dari dinding sel penghambat dan dengan demikian pengenalan DNA ke dalam sel menjadi mudah.
5. Isolasi organel lebih mudah dari protoplas daripada dari seluruh sel atau tumbuhan, terutama dalam kasus senyawa sensitif seperti m RNA dan t RNA. Pemindahan nuklei, plastida, mitokondria, ribosom, tonoplas, dll., juga mudah.
6. Seperti sel, protoplas dapat diinduksi untuk menghasilkan tanaman ‘tabung reaksi’ yang subur. Ini telah ­berhasil dicapai sejauh ini dengan lima genera yang berbeda – Daucus, Nicotiana Petunia, Asparagus dan Brassica.

Pentingnya Kultur Jaringan:

1. Kultur jaringan sangat penting dalam studi morfogenesis tanaman, fisiologi, ­percobaan biokimia, patologi, embriologi, sitologi, dll.
2. Haberlandt mencatat pentingnya kultur jaringan dalam mempelajari morfogenesis tumbuhan. Hubungan ­antara pertumbuhan dan diferensiasi dapat dipahami dengan baik dari budaya semacam itu.
3. Kultur suspensi dalam kondisi terkendali dapat digunakan untuk memecahkan banyak masalah fisiologis atau biokimia dan juga menyediakan sistem untuk produksi produk tumbuhan penting ­seperti alkaloid, steroid, vitamin, antibodi, dan enzim.
4. Kultur jaringan telah memainkan peran penting dalam produksi tanaman bebas virus, dengan kultur ujung meristem.
5. Kultur jaringan berfungsi sebagai alternatif perbanyakan vegetatif dengan cara konvensional, seperti perakaran stek. Hal ini sangat berharga dalam kasus spesies yang sulit berakar ­dan spesies seperti palem yang tidak dapat diakarkan dengan stek atau cangkok karena tidak memiliki kambium.
6. Kultur jaringan memiliki aplikasi potensial dalam pertukaran plasma nutfah dan karantina tumbuhan. Transfer bahan perbanyakan tanaman secara internasional untuk penelitian, pemuliaan, pengumpulan dan ­konservasi melibatkan risiko penyebaran hama dan patogen tanaman dalam skala besar. Kultur jaringan aseptik dapat berfungsi sebagai perlindungan karantina tambahan dalam konteks ini.
7. Dalam beberapa tahun terakhir, kebutuhan untuk menerapkan teknik in vitro untuk menanam konservasi genetik plasma nutfah liar dan mengakhiri spesies yang marah telah menjadi nyata. Untuk konservasi plasma nutfah, sel harus disimpan dalam kondisi yang memungkinkan pembelahan sel minimum. Salah satu caranya adalah dengan menyimpan sel dalam nitrogen cair yang bersuhu -196°C.