Metode Enzyme-Linked Immnoabsorbent Assay (ELISA) untuk Mendeteksi Antigen!
Metode imunoabsorben terkait-enzim dapat digunakan untuk mendeteksi antigen atau antibodi. Metode ELISA memiliki banyak keunggulan dibandingkan metode lainnya (Tabel 27.2).
Metode ELISA sensitif 10 hingga 1000 kali lipat daripada metode lama seperti aglutinasi dan imunoelektroforesis. Berbagai modifikasi ELISA tersedia, beberapa di antaranya dijelaskan di sini.
Tabel 27.2: Keuntungan enzim immunoassay
- Efek amplifikasi enzim menghasilkan pengembangan tes yang lebih sensitif
- Reagen memiliki masa simpan yang lama dan relatif murah
- Berbagai macam konfigurasi pengujian dapat dikembangkan
- Peralatan lebih murah dan tersedia secara luas
- Tidak ada bahaya radiasi
- Bisa juga dilakukan di laboratorium kecil
ELISA untuk Menguji Antibodi:
Antigen yang telah diketahui dilapiskan pada sumur pelat mikroliter (piring plastik kecil, diperlakukan untuk memaksimalkan pengikatan protein; berisi 96 sumur dengan volume 200 µl).
sebuah†”
Serum uji manusia ditambahkan ke sumur dan diinkubasi.
saya. Jika serum mengandung antibodi terhadap antigen yang dilapisi, antibodi mengikat antigen.
sebuah†”
Sumur dicuci untuk menghilangkan komponen serum yang tidak terikat.
sebuah†”
Imunoglobulin anti-manusia terkonjugasi enzim (dikenal sebagai konjugat) ditambahkan ke sumur dan diinkubasi.
- Konjugat berikatan dengan antibodi yang terikat antigen di dalam sumur.
aku aku aku. Jika serum uji tidak mengandung antibodi terhadap antigen, konjugat tetap berada dalam larutan.
sebuah†”
Sumur dicuci untuk menghilangkan konjugat yang tidak terikat.
sebuah†”
Substrat yang cocok ditambahkan ke sumur dan diinkubasi.
- Enzim konjugat dalam kompleks antigen-antibodi-konjugat bekerja pada substrat dan membelah substrat untuk menghasilkan produk berwarna. Perkembangan warna menunjukkan bahwa antibodi spesifik terhadap antigen yang terlapisi pada sumur terdapat dalam serum uji.
- Warna yang tidak berkembang menunjukkan bahwa serum uji tidak memiliki antibodi terhadap antigen yang dilapisi pada sumur.
sebuah†”
Larutan penghenti (biasanya, IN asam sulfat) ditambahkan untuk menghentikan reaksi. Kemudian pelat disimpan dalam pembaca ELISA dan kerapatan optik (OD) sumur diukur. OD sesuai dengan jumlah antibodi dalam serum uji.
Dengan menggunakan konsentrasi antibodi yang diketahui, grafik dapat dibangun. Konsentrasi antibodi diplot pada sumbu X dan OD yang sesuai diplot pada sumbu Y dan kurva digambar. Dengan menginterpolasi nilai OD serum uji, konsentrasi antibodi dalam serum uji ditentukan.
ELISA untuk Menguji Antigen:
Antibodi monoklonal yang dikenal (disebut sebagai antibodi primer) terhadap antigen dilapisi ke sumur mikrotiter.
sebuah†”
Sampel yang seharusnya mengandung antigen ditambahkan ke sumur dan diinkubasi.
saya. Jika sampel mengandung antigen yang sesuai, antigen berikatan dengan antibodi pada sumur dan membentuk kompleks antigen-antibodi.
sebuah†”
Sumur dicuci untuk menghilangkan bahan yang tidak terikat.
sebuah†”
Sebuah mAb terkonjugasi enzim yang dikenal (disebut sebagai konjugat) terhadap antigen ditambahkan ke sumur dan pelat diinkubasi.
saya. Jika sumur mengandung kompleks antigen-antibodi, konjugat mengikat antigen di kompleks.
- Jika tidak ada kompleks antigen-antibodi, konjugat tetap dalam larutan.
sebuah†”
Sumur dicuci untuk menghilangkan konjugat yang tidak terikat. Substrat yang sesuai ditambahkan dan diinkubasi.
saya. Jika ada konjugat di dalam sumur, enzim konjugat membelah substrat dan menghasilkan produk berwarna.
aku aku aku. Tidak adanya perkembangan warna menunjukkan bahwa tidak ada antigen dalam sampel (terhadap antibodi yang dilapisi pada sumur).
sebuah†”
Stop solution ditambahkan untuk menghentikan reaksi. OD dari masing-masing sumur dibaca di pembaca ELISA. Seperti yang dijelaskan sebelumnya, sebuah grafik (terdiri dari berbagai konsentrasi antigen pada sumbu X dan OD yang sesuai pada sumbu Y) dibuat dan kurva digambar. Konsentrasi antigen dalam sampel uji ditentukan oleh interpolasi OD-nya.
Metode ELISA Tangkap Antibodi:
Sumur pelat titer mikro dilapisi dengan antibodi IgM anti-manusia.
sebuah†”
Serum pasien ditambahkan dan diinkubasi. Antibodi IgM dalam serum berikatan dengan antibodi IgM anti-manusia di sumur.
Sumur dicuci dan kemudian antigen yang diketahui ditambahkan dan diinkubasi.
saya. Jika antibodi IgM terhadap antigen ada di dalam sumur, antigen akan berikatan dengan antibodi IgM dan tetap berada di dalam sumur.
sebuah†”
Sumur dicuci untuk menghilangkan antigen yang tidak terikat
sebuah†”
Enzim mAb terkonjugasi ke antigen ditambahkan dan diinkubasi.
saya. Jika antigen hadir dalam sumur (kompleks anti IgM-IgM-antigen), konjugat akan berikatan dengan antigen.
sebuah†”
Sumur dicuci untuk menghilangkan konjugat yang tidak terikat dan substrat ditambahkan.
saya. Perkembangan warna menunjukkan bahwa antibodi IgM terhadap antigen terdapat dalam serum pasien.
- Warna yang tidak berkembang menunjukkan bahwa serum pasien tidak mengandung antibodi IgM terhadap antigen.
sebuah†”
Solusi berhenti ditambahkan dan OD sumur diukur secara individual dalam pembaca ELISA. Kuantitas antibodi IgM terhadap antigen dapat ditentukan dengan menggambar grafik seperti yang dijelaskan sebelumnya.
Prosedur serupa dapat diadopsi untuk mendeteksi antibodi IgG terhadap antigen.
Enzim yang biasa digunakan dalam teknik ELISA adalah horseradish peroxidase dan alkaline phosphatase (Tabel 27.3). Enzim ini digabungkan secara kovalen dengan mAbs. Berbagai substrat ditindaklanjuti oleh enzim ini untuk menghasilkan produk berwarna. Karena langkah terakhir dari metode ELISA bersifat enzimatik, metode ELISA sangat sensitif (yaitu, konsentrasi antigen atau antibodi yang sangat rendah dapat dideteksi).
Sensitivitas uji ELISA ditingkatkan dengan menggunakan reagen tambahan (Misalnya, biotin/avidinimmunoassay). Baru-baru ini, penggunaan substrat peroksidase horseradish yang menghasilkan produk chemiluminescent semakin meningkatkan sensitivitasnya. Pengukuran laju reaksi, daripada luasnya reaksi pada satu saat tertentu, memberikan hasil ELISA kuantitatif yang lebih akurat.
Tabel 27.3: Karakteristik enzim yang digunakan dalam immunoassay enzim:
|
Karakteristik |
Peroksidase lobak |
β-Galaktosidase |
Alkali fosfatase |
|
Sumber |
lobak pedas |
Escherichia coli |
Usus sapi |
|
MW (dalton) |
Ca.40.000 |
Ca.530.000 |
140.000 |
|
Aktivitas tertentu |
250U/mg |
600U/mg |
1000U/mg |
|
Tingkat perputaran |
10.000 |
318.000 |
250.000 |
|
Pengukuran enzim |
kolorimetri, fluorometri, luminometri |
kolorimetri, fluorometri, luminometri |
kolorimetri, fluorometri, luminometri |
|
Metode pelabelan enzim |
Oksidasi berkala |
Metode Dimaleimide, reagen pengikat silang |
Metode glutaraldehida, ikatan silang |
ELISA yang Ditingkatkan Biotin-Avidin:
Alih-alih melabeli mAb dengan enzim, MAb dapat diberi label dengan biotin (Vitamin B 12 ).
sebuah†”
Kemudian enzim berlabel avidin (komponen protein putih telur) ditambahkan.
sebuah†”
Avidin berikatan dengan biotin dengan sensitivitas dan afinitas yang sangat tinggi. Selanjutnya substrat ditambahkan. Enzim (dalam mAb-biotin-avidin-enzim) kompleks bekerja pada substrat dan menghasilkan produk berwarna.
Peningkatan biotin-avidin juga digunakan dalam tes Immunofluorescent.
Immunoassay Enzim Mikropartikel:
Alih-alih melapisi sumur pelat titer mikro dengan antigen atau antibodi, manik-manik kecil (berdiameter 1 mm) dilapisi dengan antigen atau antibodi dan pengujian ELISA dilakukan. Mikropartikel menawarkan area permukaan yang lebih besar untuk pelapisan antigen atau antibodi sehingga konsentrasi antigen atau antibodi yang lebih tinggi dapat dilapisi, yang membantu mempersingkat waktu yang diperlukan untuk reaksi pengikatan.
Fluorescent enzyme immunoassay identik dengan AMDAL lain kecuali bahwa mereka menggunakan substrat fluoresen. Dalam AMDAL fluoresen, fluorofor dihasilkan oleh reaksi enzim. Mengikuti eksitasi fluorofor pada panjang gelombang optimalnya, cahaya pada panjang gelombang karakteristik dipancarkan. Cahaya neon yang dipancarkan diukur.
Fluoroimmunoassay yang diselesaikan waktu:
Metode ini memerlukan instrumentasi khusus dan label fluoresen khusus untuk meningkatkan sensitivitas pengujian. Label fluoresen yang digunakan dalam pengujian ini menunjukkan fluoresensi tertunda dengan periode waktu 100 ns atau lebih antara eksitasi dan emisi. Sebagian besar zat yang bertanggung jawab atas fluoresensi latar memiliki periode peluruhan yang singkat. Oleh karena itu, pengukuran sinyal fluoresensi tertunda akan mengurangi efek fluoresensi latar belakang.
Tujuan ini dicapai dengan penggunaan fluorometer yang diselesaikan dengan waktu khusus yang menghasilkan pulsa cahaya cepat yang menggairahkan fluorofor. Fluoresensi diukur beberapa saat setelah eksitasi. Dengan demikian, pengaruh background non spesifik, yang umumnya meluruh dalam waktu kurang dari 10 ns dapat dihilangkan.
Fluorofor yang menunjukkan fluoresensi tertunda adalah:
saya. Turunan pirena dengan waktu peluruhan hampir 100 ns.
- Label kelat logam tanah jarang [seperti europium (Eu 3+ ), samarium (Sm 3+ ), dan terbium (Tb 3+ )] yang memiliki waktu peluruhan sangat lama sekitar 50 sampai 100 µs.
Immunoassay Chemiluminescent:
Chemiluminescent immunoassays (CL-EIAs) menggunakan substrat chemiluminescent yang bereaksi dengan berbagai enzim. Reaksi substrat-enzim chemiluminescent menghasilkan cahaya, mirip dengan bioluminescence. Sistem EIA chemiluminescent adalah peningkatan yang pasti dibandingkan RIA dalam hal sensitivitas, efisiensi waktu, dan kesederhanaan prosedural.
Immunoassay chemiluminescence menggunakan molekul penghasil chemiluminescence sebagai label.
saya. Turunan luminol
- Ester acridinium
aku aku aku. Turunan nitrofenil oksalat
- Rutenium tri-bipridyl dengan tripropilamina untuk elektrokimialuminesensi
- Pada dasarnya, metode assay tidak berbeda dengan RIA/FIA.
