Deoxyribonuclease Test (DNase Test) pada Bakteri untuk Mengetahui Kemampuannya Menghidrolisis DNA (Dengan Gambar)!
Prinsip:
Beberapa bakteri memiliki kemampuan untuk menghidrolisis asam deoksiribonukleat (DNA) menjadi oligonukleotida, karena mereka dapat menghasilkan enzim hidrolitik ekstraseluler ‘deoxyribonuclease’ (DNase).
Sementara DNA diendapkan oleh opasitas penghasil asam klorida, produk akhirnya yang dihidrolisis, oligonukleotida, tidak diendapkan oleh asam klorida, yang tidak menghasilkan opasitas seperti itu; justru menghasilkan transparansi.
Pada uji DNase, bakteri uji ditumbuhkan pada pelat agar yang mengandung DNA. Setelah koloni bakteri terlihat, lempeng dibanjiri dengan asam klorida. Jika bakteri memiliki kemampuan untuk menghidrolisis DNA, koloninya menghidrolisis DNA dalam medium di area sekitarnya, sedangkan area lempeng lainnya mengandung DNA yang tidak terhidrolisis.
Akibatnya, ketika dibanjiri dengan asam klorida, zona bening transparan terbentuk di sekitar koloni, karena produk terhidrolisis, oligonukleotida, yang terbentuk di sekitarnya tidak membentuk endapan dengan asam klorida.
Di sisi lain, area pelat lainnya menjadi buram, karena DNA yang tidak terhidrolisis di area ini membentuk endapan dengan asam klorida. Jika toluidin biru digunakan sebagai pengganti asam klorida, halo berwarna merah muda mawar hanya dihasilkan di sekitar koloni.
Bahan yang Dibutuhkan:
Cawan petri, labu berbentuk kerucut, sumbat kapas, loop inokulasi, autoklaf, pembakar bunsen, ruang aliran laminar, tabung pembuangan, inkubator, agar DNase, asam klorida IN (atau 0,1% toluidin biru), koloni terisolasi atau biakan murni bakteri.
Prosedur:
- Dua cawan petri dibersihkan, ditutup dengan kertas kerajinan dan diikat dengan benang atau karet gelang (Gambar 7.23). Langkah ini serta sterilisasi cawan petri pada langkah 6 dihilangkan, jika cawan petri yang disterilkan dengan oven digunakan secara langsung.
- Bahan media agar DNase (yang mengandung DNA sebagai komponen utama) atau bubuk siap pakai yang dibutuhkan sebanyak 100 ml media ditimbang dan dilarutkan dalam 100 ml air suling dalam labu berbentuk kerucut 250 ml dengan cara dikocok dan diaduk.
- Ditentukan pH-nya menggunakan kertas pH atau pH meter dan diatur menjadi 7,2 menggunakan HCI 0,1N jika lebih atau menggunakan NaOH 0,1N jika kurang.
- Labu dipanaskan untuk melarutkan agar-agar dalam media secara sempurna.
- Labu ditutup dengan kapas, ditutup dengan kertas kerajinan dan diikat dengan benang atau karet gelang.
- Dua cawan petri dan labu berbentuk kerucut berisi media agar DNase disterilkan pada suhu 121 °C (tekanan 15 psi) selama 15 menit dalam autoklaf.
- Setelah sterilisasi, dikeluarkan dari autoklaf dan dibiarkan dingin beberapa saat, tanpa membiarkan media mengeras. Pendinginan medium mencegah kondensasi dan akumulasi tetesan air di dalam pelat. Jika media telah disiapkan dan dipadatkan selama penyimpanan, maka harus dicairkan dengan cara dipanaskan secara hati-hati sampai benar-benar meleleh.
- Untuk menyiapkan pelat agar DNase, sebelum media agar DNase yang disterilkan mendingin dan mengeras, dalam kondisi cair yang hangat, dituangkan secara aseptis, sebaiknya di dalam ruang aliran laminar, ke dalam dua cawan petri yang disterilkan (masing-masing sekitar 20 ml), sehingga media cair menutupi bagian bawah cawan petri sepenuhnya.
Kemudian, pelat ditutup dengan tutupnya dan dibiarkan dingin, untuk memadatkan media di dalamnya. Uap air yang mungkin mengembun pada permukaan bagian dalam pelat dan tutup diuapkan dengan menjaga pelat dan tutup dalam posisi terbalik di dalam inkubator pada suhu 37°C selama kurang lebih 1 jam.
- Setiap lempeng diberi tanda di sisi bawah menjadi empat bagian.
- “Spot inoculation” bakteri uji dilakukan secara aseptis, sebaiknya di dalam ruang aliran laminar, di tengah setiap kuartal dengan membuat noda (atau apusan kecil) bakteri dengan bantuan loop yang disterilkan dengan api. Loop disterilkan setelah setiap inokulasi.
- Pelat yang telah diinokulasi diinkubasi dengan posisi terbalik, dari atas ke bawah, pada suhu 37°C selama 24 sampai 48 jam dalam inkubator sampai terlihat koloni bakteri.
- Pelat dibanjiri dengan larutan asam klorida 1 N (atau 0,1% toluidin biru).
Pengamatan:
- Zona bening transparan (atau halo merah muda) terbentuk di sekitar koloni: DNase positif.
- Zona bening transparan (atau lingkaran cahaya merah muda) tidak terbentuk di sekitar koloni: DNase negatif.
