Uji Hidrolisis Pati pada Bakteri untuk mengetahui Kemampuannya Menghidrolisis Pati!
Prinsip:
Beberapa bakteri memiliki kemampuan untuk menghidrolisis pati, karena dapat menghasilkan enzim sakarolitik.
Sementara pati membentuk warna biru tua dengan yodium, produk akhirnya yang dihidrolisis tidak memperoleh warna biru tua dengan yodium.
Pada uji hidrolisis pati, bakteri uji ditumbuhkan pada media agar yang mengandung pati. Setelah koloni bakteri terlihat, lempeng dibanjiri dengan larutan yodium. Jika bakteri memiliki kemampuan untuk menghidrolisis pati, maka koloninya menghidrolisis pati dalam media di daerah sekitarnya, sedangkan bagian lempeng lainnya mengandung pati yang tidak terhidrolisis.
Akibatnya, ketika dibanjiri dengan larutan yodium, zona bening transparan terbentuk di sekitar koloni, karena produk terhidrolisis yang terbentuk di sekitarnya tidak membentuk warna biru tua dengan yodium. Di sisi lain, area pelat lainnya menjadi biru tua, karena yodium membentuk warna biru tua dengan pati yang tidak terhidrolisis di area ini.
Bahan yang Dibutuhkan:
Cawan petri, labu berbentuk kerucut, sumbat kapas, loop inokulasi, autoklaf, pembakar bunsen, ruang aliran laminar, tabung pembuangan, inkubator, agar kanji, larutan yodium Lugol, koloni terisolasi atau biakan murni bakteri.
Prosedur:
- Dua cawan petri dibersihkan, ditutup dengan kertas kerajinan dan diikat dengan benang atau karet gelang (Gambar 7.21). Langkah ini serta sterilisasi cawan petri pada langkah 6 dihilangkan, jika cawan petri yang disterilkan dengan oven digunakan secara langsung.
- Bahan media agar pati (mengandung pati sebagai komponen utama) atau bubuk siap pakai yang diperlukan untuk 100 ml media ditimbang dan dilarutkan dalam 100 ml air suling dalam labu berbentuk kerucut 250 ml dengan cara dikocok dan diaduk.
- Ditentukan pH-nya menggunakan kertas pH atau pH meter dan diatur menjadi 7,2 menggunakan HCI 0,1N jika lebih atau menggunakan NaOH 0,1N jika kurang.
- Labu dipanaskan untuk melarutkan agar-agar dalam media secara sempurna.
- Labu ditutup dengan kapas, ditutup dengan kertas kerajinan dan diikat dengan benang atau karet gelang.
- Dua cawan petri dan labu berbentuk kerucut berisi media agar kanji disterilkan pada suhu 121°C (tekanan 15 psi) selama 15 menit dalam autoklaf.
- Setelah sterilisasi, dikeluarkan dari autoklaf dan dibiarkan dingin beberapa saat, tanpa membiarkan media mengeras. Pendinginan medium mencegah kondensasi dan akumulasi tetesan air di dalam pelat. Jika media telah disiapkan dan dipadatkan selama penyimpanan, maka harus dicairkan dengan cara dipanaskan secara hati-hati sampai benar-benar meleleh.
- Untuk menyiapkan cawan agar kanji, sebelum media agar kanji yang telah disterilkan mendingin dan memadat, dalam kondisi cair yang hangat, dituang secara aseptis, sebaiknya di dalam laminar flow chamber, ke dalam dua cawan petri yang telah disterilkan (masing-masing kurang lebih 20 ml), sehingga media cair menutupi bagian bawah cawan petri sepenuhnya.
Kemudian, pelat ditutup dengan penutupnya dan dibiarkan dingin, sehingga memadatkan media di dalamnya. Uap air yang mungkin mengembun pada permukaan bagian dalam pelat dan tutup diuapkan dengan menjaga pelat dan tutup dalam posisi terbalik di dalam inkubator pada suhu 37°C selama kurang lebih 1 jam.
- Setiap lempeng diberi tanda di sisi bawah menjadi empat bagian.
- “Spot inoculation” bakteri uji dilakukan secara aseptis, sebaiknya di dalam ruang aliran laminar, di tengah setiap kuartal dengan membuat noda (atau apusan kecil) bakteri dengan bantuan loop yang disterilkan dengan api. Loop disterilkan setelah setiap inokulasi.
- Pelat yang telah diinokulasi diinkubasi dengan posisi terbalik, dari atas ke bawah, pada suhu 37°C selama 24 sampai 48 jam dalam inkubator sampai terlihat koloni bakteri.
- Pelat dibanjiri dengan larutan yodium Lugol.
Pengamatan:
- Terbentuk zona bening transparan di sekitar koloni bakteri: Hidrolisis pati positif.
- Zona bening transparan tidak terbentuk di sekitar koloni bakteri: Hidrolisis pati negatif.
