Uji Oksidase pada Bakteri untuk Mengetahui Kemampuannya Menghidrolisis Gelatin dengan Memproduksi Gelatinase!
Prinsip:
Beberapa bakteri memiliki kemampuan menghidrolisis gelatin, karena dapat menghasilkan enzim proteolitik ‘gelatinase’.
Sementara gelatin diendapkan oleh merkuri klorida yang menghasilkan translusensi, produk akhir yang dihidrolisis tidak diendapkan oleh merkuri klorida, yang mana mereka tidak menghasilkan tembus cahaya seperti itu, melainkan menghasilkan transparansi.
Pada uji gelatinisasi, bakteri uji ditumbuhkan pada cawan agar yang mengandung gelatin. Setelah koloni bakteri terlihat, lempeng dibanjiri dengan larutan merkuri klorida. Jika bakteri memiliki kemampuan untuk menghidrolisis gelatin, koloninya menghidrolisis gelatin dalam medium di area sekitarnya, sedangkan area lempeng lainnya mempertahankan gelatin yang tidak terhidrolisis.
Akibatnya, ketika dibanjiri dengan larutan merkuri klorida, zona bening transparan terbentuk di sekitar koloni, karena produk terhidrolisis yang terbentuk di sekitarnya tidak membentuk endapan dengan merkuri klorida. Di sisi lain, area pelat lainnya menjadi tembus cahaya, karena gelatin yang tidak terhidrolisis di area ini membentuk endapan dengan merkuri klorida.
Bahan yang Dibutuhkan:
Cawan petri, labu berbentuk kerucut, sumbat kapas, loop inokulasi, autoklaf, pembakar bunsen, ruang aliran laminar, tabung pembuangan, inkubator, agar-agar Fraizer, larutan merkuri klorida, koloni terisolasi atau biakan murni bakteri.
Prosedur:
- Dua cawan petri dibersihkan, ditutup dengan kertas kerajinan dan diikat dengan benang atau karet gelang (Gambar 7.20). Langkah ini serta sterilisasi cawan petri pada langkah 6 dihilangkan, jika cawan petri yang disterilkan dengan oven digunakan secara langsung
- Bahan-bahan media agar-agar Fraizer (mengandung gelatin sebagai komponen utama) atau bubuk siap pakai yang diperlukan untuk 100 ml media ditimbang dan dilarutkan dalam 100 ml air suling dalam labu berbentuk kerucut 250 ml dengan cara dikocok dan diaduk .
- Ditentukan pH-nya menggunakan kertas pH atau pH meter dan diatur menjadi 7,2 menggunakan HCI 0,1N jika lebih atau menggunakan NaOH 0,1N jika kurang.
- Labu dipanaskan untuk melarutkan agar-agar dalam media secara sempurna.
- Labu ditutup dengan kapas, ditutup dengan kertas kerajinan dan diikat dengan benang atau karet gelang.
- Dua cawan petri dan labu berbentuk kerucut yang berisi media agar-agar Fraizer disterilkan pada suhu 121°C (tekanan 15 psi) selama 15 menit dalam autoklaf.
- Setelah sterilisasi, mereka dikeluarkan dari autoklaf dan dibiarkan dingin beberapa saat tanpa membiarkan media memadat. Pendinginan medium mencegah kondensasi dan akumulasi tetesan air di dalam pelat. Jika media telah disiapkan dan dipadatkan selama penyimpanan, maka harus dicairkan dengan cara dipanaskan secara hati-hati sampai benar-benar meleleh.
- Untuk menyiapkan pelat agar gelatin, sebelum media agar gelatin Frazier yang disterilkan mendingin dan memadat, dalam kondisi cair yang hangat, dituangkan secara aseptis, sebaiknya di dalam ruang aliran laminar, ke dalam dua cawan petri yang disterilkan (masing-masing sekitar 20 ml), jadi bahwa media cair menutupi bagian bawah cawan petri sepenuhnya.
Kemudian, pelat ditutup dengan tutupnya dan dibiarkan dingin, untuk memadatkan media di dalamnya. Uap air yang mungkin mengembun pada permukaan bagian dalam pelat dan tutup diuapkan dengan menjaga posisi pelat dan tutup terbalik di dalam inkubator pada suhu 37°C selama kurang lebih 1 jam.
- Setiap lempeng diberi tanda di sisi bawah menjadi empat bagian.
- “Spot inoculation” bakteri uji dilakukan secara aseptis, sebaiknya di dalam ruang aliran laminar, di tengah setiap kuartal dengan membuat noda (atau apusan kecil) bakteri dengan bantuan loop yang disterilkan dengan api. Loop disterilkan setelah setiap inokulasi.
- Pelat yang telah diinokulasi diinkubasi dengan posisi terbalik, dari atas ke bawah, pada suhu 37°C selama 24 sampai 48 jam dalam inkubator sampai terlihat koloni bakteri.
- Pelat dibanjiri dengan larutan merkuri klorida (HgCl 2 ).
Pengamatan:
Zona bening transparan terbentuk di sekitar koloni bakteri: Gelatinase positif.
Zona bening transparan tidak terbentuk di sekitar koloni bakteri: Gelatinase negatif.
