Hewan Transgenik: Tujuan Transfer Gen dengan Metode Transfeksi Berbeda!
Hewan transgenik mengandung genomnya, gen atau gen yang diperkenalkan oleh satu atau teknik transfeksi lainnya.
Gen yang diperkenalkan melalui transfeksi disebut transgen. Pada hewan, transfeksi menentukan pengenalan segmen DNA, baik telanjang atau diintegrasikan ke dalam vektor, ke dalam sel hewan.
Tujuan Transfer Gen:
- Modifikasi genetik hewan dapat ditujukan untuk meningkatkan produksi susu, daging, wol, dll.
- Gen telah dipindahkan ke hewan untuk mendapatkan produksi protein skala besar yang dikodekan oleh gen ini di dalam susu, urin, atau darah hewan tersebut.
- Suatu kasus khusus dari transfer gen bertujuan untuk mengurangi atau bahkan menghilangkan gejala dan penderitaan akibat penyakit genetik. Dalam pendekatan ini, salinan normal dan fungsional dari gen yang rusak dimasukkan ke pasien (terapi gen).
- Galur atau galur hewan transgenik khusus dibuat untuk memenuhi kebutuhan eksperimen dan/atau biomedis khusus.
Metode Transfeksi:
Beberapa pendekatan yang telah digunakan untuk introduksi DNA ke dalam sel/embrio hewan adalah sebagai berikut:
(i) Presipitasi kalsium fosfat.
(ii) Injeksi mikro langsung.
(iii) Infeksi retrovirus.
(iv) Lipofeksi.
(v) Pengiriman senjata partikel dan
(vi) Elektropoiasi.
Presipitasi Kalsium Fosfat:
Dalam pendekatan ini, preparat DNA yang akan digunakan untuk transfeksi pertama-tama dilarutkan dalam dapar fosfat. Larutan kalsium klorida kemudian ditambahkan ke larutan DNA; ini mengarah pada pembentukan kalsium fosfat yang tidak larut yang ikut mengendap dengan DNA. Endapan kalsium fosfat-DNA ditambahkan ke sel untuk ditransfeksi.
Partikel endapan diambil oleh sel melalui fagositosis. Awalnya, 1-2% sel ditransfusikan dengan pendekatan ini. Tetapi prosedurnya sekarang telah dimodifikasi untuk mendapatkan transfeksi hingga 20% sel. Dalam sebagian kecil sel yang ditransfusikan, DNA menjadi terintegrasi ke dalam genom sel yang menghasilkan transfeksi yang stabil atau permanen.
Pendekatan umum ini dapat diterapkan pada hampir semua sel mamalia, dan sejumlah besar sel dapat ditangani dengan sedikit usaha. Tetapi banyak garis sel tidak menyukai endapan kalsium fosfat yang melekat pada permukaan atau substratnya.
Lipofeksi:
Pengiriman DNA ke dalam sel menggunakan liposom disebut lipofeksi. Liposom adalah vesikel kecil yang dibuat dari lipid yang sesuai. Awalnya, lipid nonionik digunakan untuk menyiapkan liposom sehingga DNA harus dimasukkan ke dalam vesikel mengikuti prosedur enkapsulasi khusus.
Penggunaan lipid kationik untuk konstruksi liposom adalah keuntungan tersendiri karena DNA secara spontan dan efisien kompleks dengan liposom ini membuat prosedur enkapsulasi tidak diperlukan. Liposom kationik memiliki membran bilayer lipid tunggal (unilamellar), dan mereka berikatan dengan sel secara efisien. Mungkin mereka menyatu dengan membran plasma dan dengan demikian mengirimkan DNA (dikomplekskan dengannya) ke dalam sel, yang menghasilkan transfeksi.
Lipofeksi adalah metode pilihan untuk transfeksi sel mamalia in vitro. Itu juga telah digunakan untuk mengirimkan DNA ke dalam hewan hidup dengan injeksi langsung atau injeksi intravena. Liposom kationik telah digunakan dalam injeksi intravena atau intratrakeal pada tikus untuk ekspresi gen penanda di paru-paru. Pengiriman yang ditargetkan juga telah ditunjukkan dengan memasukkan protein ligan spesifik ke dalam membran liposom.
Infeksi Retroviral:
Retrovirus rekombinan menghasilkan virion, yang digunakan untuk menginfeksi sel hewan dan embrio tikus. Genom RNA retrovirus rekombinan disalin oleh reverse transcriptase untuk menghasilkan salinan DNA (transkripsi pendapatan), yang menjadi terintegrasi ke dalam genom sel. Reverse transcriptase dikodekan oleh retrovirus, dan diproduksi segera setelah infeksi.
Namun, transkripsi balik hanya dapat terjadi pada sel-sel yang melewati fase S, yaitu aktif secara mitosis. Salinan DNA dari retrovirus rekombinan berintegrasi ke dalam genom seluler di lokasi acak, dan biasanya tidak disertai dengan penghapusan atau penataan ulang.
Mikroinjeksi:
Dalam metode ini, larutan DNA disuntikkan langsung ke dalam inti sel atau ke dalam pronukleus jantan dari ovum satu sampai dua sel yang telah dibuahi. Biasanya, perakitan mikroinjeksi terdiri dari mikroskop diseksi stereoskopik berdaya rendah (untuk melihat sel telur dan seluruh proses) dan dua mikromanipulator, satu untuk mikropipet kaca untuk menahan sel telur dengan pengisapan sebagian dan yang lainnya untuk jarum injeksi kaca untuk memasukkan sel telur. DNA ke dalam pronukleus pria. Pronukleus jantan jauh lebih besar daripada pronukleus betina dari ovum mamalia yang telah dibuahi. Namun pada ovum ikan, DNA disuntikkan ke dalam sitoplasma telur.
Prosedur umum untuk mikroinjeksi adalah sebagai berikut: Donor betina diinduksi untuk melakukan superovulasi dengan menggunakan perawatan hormon yang tepat. Betina superovulasi kemudian dikawinkan dengan jantan subur, dan sejumlah besar ovum/embrio satu atau dua sel yang telah dibuahi dikumpulkan melalui pembedahan. Sebagai alternatif, ovum yang tidak dibuahi dikumpulkan dari betina yang mengalami superovulasi; ovum kemudian dibuahi secara in vitro. Konstruk transgen disiapkan dalam larutan buffer dan disuntikkan ke dalam pronuctei jantan dari telur yang telah dibuahi menggunakan rakitan mikroinjeksi.
