In dole Test untuk Mengetahui Kemampuan Bakteri Menghidrolisis Asam Amino Triptofan!
Prinsip:
Beberapa bakteri memiliki kemampuan menghidrolisis asam amino triptofan menjadi indol, karena dapat menghasilkan enzim ‘triptofanase’.
Triptofan dihidrolisis dengan produksi indole, asam piruvat dan amonia. Indole dideteksi oleh reagen warna, paradimethylaminobenzaldehyde (p-DMAB, yaitu reagen Kovac), yang menghasilkan cincin merah muda. Indole bereaksi dengan p-DMAB menghasilkan senyawa ‘quinoidal red violet compound (pewarna rosindole)’ yang berwarna merah muda. Cincin diproduksi di permukaan, karena reagen disiapkan dalam alkohol amil.
Pada uji indol, bakteri uji ditumbuhkan dalam media kaldu yang mengandung triptofan. Jika bakteri memiliki kemampuan untuk menghidrolisis triptofan menjadi indol, cincin merah muda terbentuk di permukaan biakan kaldu setelah penambahan p-DMAB.
Bahan yang Dibutuhkan:
Tabung reaksi, labu berbentuk kerucut, sumbat kapas, loop inokulasi, autoklaf, pembakar bunsen, ruang aliran laminar, tabung pembuangan, inkubator, kaldu tryptone, reagen Kovac (para dimethylaminobenzaldehyde), koloni terisolasi atau kultur bakteri murni.
Prosedur:
- Bahan media tryptone broth atau bubuk siap pakainya yang dibutuhkan sebanyak 100 ml kaldu ditimbang dan dilarutkan dalam 100 ml air suling dalam labu berbentuk kerucut 250 ml dengan cara dikocok dan diaduk. Tryptone bertindak sebagai sumber triptofan. Oleh karena itu, penambahan triptofan ke dalam kaldu bersifat opsional (Gambar 7.3).
- Ditentukan pH-nya menggunakan kertas pH atau pH meter dan diatur menjadi 7,5 menggunakan HC1 0,1N jika lebih banyak atau menggunakan NaOH 0,1N jika lebih sedikit. Labu dipanaskan, jika perlu, untuk melarutkan bahan sepenuhnya.
- Kaldu disebarkan ke dalam lima tabung reaksi (masing-masing kurang lebih 5 ml), ditutup dengan kapas, ditutup dengan kertas kerajinan dan diikat dengan benang atau karet gelang.
- Tabung kaldu disterilkan pada suhu 121 °C (tekanan 15 psi) selama 15 menit dalam autoklaf.
- Tabung kaldu dibiarkan dingin hingga suhu kamar.
- Bakteri uji diinokulasi secara aseptis, sebaiknya dalam ruang aliran laminar, ke dalam kaldu dengan bantuan loop inokulasi yang disterilkan di atas api bunsen. Loop disterilkan setelah setiap inokulasi.
- Tabung kaldu yang telah diinokulasi diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam dalam inkubator.
- Reagen warna, para-dimethylaminobenzaldehyde (p-DMAB), (yaitu reagen Kovac) diteteskan ke dalam tabung kaldu (masing-masing 0,5 ml) dan diamati setelah 1 menit.
Kalau tidak:
- Potongan kertas yang dibasahi asam oksalat diletakkan di mulut tabung kaldu yang telah diinokulasi, sehingga kira-kira setengah dari potongan kertas tetap berada di dalam tabung tanpa menyentuh kaldu dan separuh lainnya tetap berada di luar. Untuk ini, kertas saring dipotong menjadi strip dengan panjang sekitar 35 mm dan lebar 5 mm. Strip direndam dalam larutan asam oksalat berair jenuh panas dan dikeringkan sebelum digunakan.
- Tabung kaldu yang telah diinokulasi diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam dalam inkubator.
Pengamatan:
- Cincin merah muda diproduksi:
Indole positif (yaitu bakteri dapat mengubah triptofan menjadi indol).
- Cincin merah muda tidak diproduksi:
Indole negatif (yaitu bakteri tidak dapat mengubah triptofan menjadi indol).
Kalau tidak:
- Warna merah muda yang dihasilkan pada strip kertas:
Indole positif (yaitu bakteri dapat mengubah triptofan menjadi indol).
- Warna pink tidak dihasilkan pada strip kertas:
Indole negatif (yaitu bakteri tidak dapat mengubah triptofan menjadi indol).
