Beberapa langkah utama yang terlibat dalam reaksi berantai polimerase dalam sekuens DNA adalah: 1. Langkah 1: Denaturasi oleh Panas 2. Langkah 2: Menganil Primer ke Urutan Target 3. Langkah 3: Ekstensi 4. Langkah 4: Akhir Siklus PGR Pertama .
Reaksi berantai polimerase (PGR) menguatkan sepotong DNA di beberapa kali lipat, lihat gambar 6.2. Ini adalah penciptaan ribuan hingga jutaan salinan dari urutan DNA tertentu.
PGR adalah proses atau siklus tiga langkah. Ini diulang beberapa kali. Setelah siklus PGR terdiri dari langkah-langkah yaitu Denaturasi, Annealing dan Extension. Sebuah instrumen secara otomatis mengontrol proses yang berlangsung di dalam thermal cycler, suhu bergantian untuk periode waktu terprogram untuk jumlah siklus PGR yang sesuai.
1. Langkah 1: Denaturasi oleh Panas:
Panas yang normalnya lebih dari 90 derajat Celcius dapat memisahkan DNA beruntai ganda menjadi dua untai tunggal. Proses ini dikenal sebagai “denaturasi”. Ikatan hidrogen yang menghubungkan basa satu sama lain lemah, oleh karena itu denaturasi dimungkinkan. Ikatan hidrogen putus pada suhu tinggi, sedangkan ikatan antara deoksiribosa dan fosfat, tetap utuh karena lebih kuat tetap utuh.
2. Langkah 2: Anil Primer ke Urutan Target:
Tujuan akhir dari PGR adalah untuk mereplikasi urutan target sekitar 100-600 pasangan basa unik untuk organisme yang sedang dipelajari. Menargetkan urutan dicapai dengan menggunakan primer. Primer menandai ujung urutan target.
AMPLICOR® Test primers pendek, sekuens sintetik dari DNA beruntai tunggal biasanya terdiri dari 20-30 basa, dengan ujung 5′ berlabel biotin untuk membantu deteksi. Untuk wilayah target organisme, ZPT spesifik memiliki dua primer, satu untuk masing-masing untai DNA tunggal komplementer yang dihasilkan selama denaturasi untai DNA tunggal yang dihasilkan selama denaturasi.
Awal urutan target DNA yang menarik ditandai dengan primer yang anil (mengikat) ke urutan komplementer. Annealing biasanya terjadi antara 40 derajat Celcius dan 65 derajat Celcius, tergantung pada panjang dan urutan dasar primer.
3. Langkah 3: Ekstensi:
Suhu dinaikkan menjadi sekitar 72 derajat Celcius setelah primer dianil ke sekuens DNA komplementer. Juga, enzim Taq DNA polimerase digunakan untuk mereplikasi untaian DNA. Taq DNA polimerase adalah DNA polimerase termostabil rekombinan dari organisme Thermus Aquaticus dan tidak seperti enzim polimerase normal yang aktif pada suhu tinggi.
Proses sintesis mensintesis molekul DNA beruntai ganda baru, keduanya identik dengan wilayah DNA target beruntai ganda asli, dengan memfasilitasi pengikatan dan penggabungan nukleotida komplementer yang bebas dalam larutan (dNTP). Perpanjangan selalu dimulai pada ujung 3′ dari primer membuat untai ganda dari masing-masing dua untai tunggal. Taq DNA polimerase mensintesis secara eksklusif dalam arah 5′ ke 3′.
4. Langkah 4: Akhir Siklus ZPT Pertama:
Sekarang ada dua untai DNA baru yang identik dengan target awal pada akhir siklus ZPT pertama. Untaian yang baru terbentuk memiliki permulaan, yang secara tepat ditentukan oleh ujung 5′ dari primer, tetapi ujung 3′ tidak ditentukan secara tepat.
Untai DNA yang disintesis dari cetakan semacam itu kemudian memiliki panjang yang ditentukan secara tepat yang dibatasi di kedua ujungnya oleh ujung 5′ dari masing-masing dua primer. Untaian DNA ini dikenal sebagai AMPLIGON. Untai DNA yang sesuai dengan urutan target. Setelah hanya beberapa siklus, hadir dalam jumlah yang jauh lebih besar daripada urutan panjang variabel. Urutan diapit atau ditentukan oleh dua primer adalah bagian yang diperkuat.
