Tes Fungsi Neutrofil!
- Kemotaksis neutrofil dapat dinilai dengan metode berikut:
sebuah. Pengujian ruang Boyden yang dimodifikasi:
Ruang Boyden terdiri dari ruang atas dan bawah yang dipisahkan oleh filter dengan ukuran pori kecil.
Suspensi neutrofil ditempatkan di ruang atas dan zat kemotaktik ditempatkan di ruang bawah. Tingkat migrasi neutrofil dinilai dengan menghitung jumlah neutrofil yang terperangkap dalam filter dan jumlah neutrofil di ruang bawah dengan flow cytometry.
b. Sumur dilubangi dalam agar semipadat:
Suspensi neutrofil, zat kemotaktik, dan zat non kemotaktik ditempatkan pada sumur yang berbeda. Migrasi sel melalui agar semi padat menuju sumur yang mengandung zat kemotaktik ditentukan secara mikroskopis. Migrasi menuju zat non-kemotaktik dengan baik mewakili gerakan acak sel (dikenal sebagai chemo kinesis).
2. Fagositosis neutrofil:
Berbagai partikel dapat digunakan untuk menilai kapasitas fagositik neutrofil. Partikel diinkubasi dengan neutrofil dan kemudian diamati secara mikroskopis untuk keberadaan partikel di dalam neutrofil. Partikel yang terikat permukaan sel dihilangkan dengan perlakuan asam, sehingga partikel yang terikat permukaan sel tidak dihitung sebagai partikel intraseluler.
Partikel berlabel fluoresen atau radioaktif yang memungkinkan penghitungan langsung partikel oleh fagosit juga sekarang tersedia.
3. Penentuan ledakan pernapasan dan degranulasi:
Penyakit granulomatosa kronis (CGD) adalah penyakit imunodefisiensi dimana pembunuhan intraseluler oleh fagosit dipengaruhi karena ketidakmampuan sel fagosit untuk menghasilkan anion oksida super (O 2 – ).
sebuah. Tes slide Nitroblue tetrazolium (NBT):
NBT adalah pewarna bening, kuning, dan larut dalam air. NBT direduksi menjadi biru tua, formazon oleh O 2 – . Neutrofil diaktifkan dengan pengobatan dengan PMA atau paparan LPS. Neutrofil yang teraktivasi kemudian diinkubasi dengan NBT. Jika neutrofil menghasilkan O 2 – , NBT direduksi menjadi formazon biru tua dan divisualisasikan di bawah mikroskop. Uji kuantitatif dapat dilakukan dengan mengekstraksi formazon dari neutrofil dan menguji formazon dengan spektrofotometer. Anak-anak dengan defisiensi lengkap aktivitas oksidase NADPH menunjukkan defisiensi berat dalam tes NBT. Tetapi Anak-anak dengan hilangnya sebagian aktivitas oksidase NADPH lebih baik dideteksi dengan uji kuantitatif.
- Uji aliran sitometrik menggunakan 2’7′-diklorofluoresensi (DCF):
O 2 – terbentuk selama aktivitas oksidase NADPH diubah menjadi H 2 O 2 oleh enzim superoksida dismutase. H 2 O 2 adalah bahan kimia mikrobisida lainnya. H 2 O 2 mengoksidasi senyawa DCF non-fluorescent menjadi senyawa fluoresen, yang terdeteksi oleh flow cytometer.
Fagosit diinkubasi dengan DCF dan DCF masuk ke dalam sel.
sebuah†”
Kemudian neutrofil diaktifkan oleh PMA atau agen lain.
sebuah†”
Kemudian sel-sel tersebut dianalisis dalam flow cytometer. Peningkatan kemekaran fagosit ditentukan.
Flow cytometer juga memungkinkan penentuan kuantitatif H 2 O 2 yang diproduksi oleh sel individu. Oleh karena itu analisis flow cytometric berguna dalam mendeteksi cacat parsial pada fungsi oksidase NADPH atau untuk skrining pembawa heterozigot dari bentuk CGD terkait-X.
4. Degranulasi fagosit:
Degranulasi fagositik adalah proses fusi lisosom dengan fagosom, yang mengarah ke pembuangan konten lisosom ke dalam fagolisosom. Degranulasi adalah proses aktif dan membutuhkan energi. Gangguan jalur metabolisme normal neutrofil (terutama, konsumsi oksigen dan meatabolisme glukosa melalui shunt heksosa monofosfat) mengganggu degranulasi; akibatnya, pembunuhan mikroba intraseluler oleh fagosit terpengaruh.
Degranulasi fagosit dalam suspensi dapat diinduksi oleh berbagai agen pengaktif dan senyawa yang memengaruhi sitoskeleton sel (seperti sitokalasin B). Fagosit melepaskan terutama granula sekunder dan tersier dan diukur dengan metode ELISA.
saya. Laktoferin (granul neutrofil sekunder) digunakan sebagai penanda pelepasan granul sekunder.
- Albumin diuji sebagai ukuran pelepasan granula tersier.
Pengujian pelepasan granula primer dari fagosit dilakukan dengan mencari pelepasan granula primer ke dalam ruang tertutup. Frustrasi fagositosis adalah uji yang digunakan untuk menilai pelepasan granula primer (Gambar 27.7).
Imunoglobulin teragregasi panas atau kompleks imun difiksasi pada cawan petri.
sebuah†”
Neutrofil ditambahkan ke cawan petri dan diinkubasi. Melalui reseptor Fc mereka, neutrofil berikatan dengan daerah Fc kompleks imun atau imunoglobulin agregat panas. Akibatnya, neutrofil mencoba memfagositosis kompleks imunoglobulin atau imun yang terkumpul dalam panas. Tetapi neutrofil tidak dapat memfagositosisnya (karena menempel pada cawan petri). Akibatnya, neutrofil melepaskan konten granular mereka di atasnya.
sebuah†”
Laju pelepasan protein granula primer, seperti myeloperoxidase atau β-glucoronidase digunakan untuk memperkirakan degranulasi. Kekurangan dalam sintesis granula primer/sekunder juga dapat dideteksi dengan pewarnaan granula intraseluler dengan mAb berlabel dan flow cytometry.
Pembunuhan Bakteri oleh Neutrofil:
Tes mikrobisida sulit dilakukan. Umumnya, uji mikrobisida dilakukan bila uji yang lebih sederhana tidak memberikan informasi yang memadai.
Staphylococcus aureus strain 502A umumnya digunakan untuk menilai kapasitas mikrobisidal neutrofil.
Staphylococcus aureus strain 502A yang tumbuh pada fase log diinkubasi dengan serum manusia (untuk menyediakan protein imunoglobulin dan komplemen untuk bertindak sebagai opsonin).
sebuah†”
Neutrofil yang baru diisolasi ditambahkan pada konsentrasi 5-10 bakteri/neutrofil.
sebuah†”
Setelah 30 menit inkubasi, bakteri yang tidak ditelan oleh neutrofil dibunuh dengan penambahan obat gentamisin. (Gentamidn tidak masuk ke dalam neutrofil dan karenanya bakteri fagositosis tetap hidup.)
sebuah†”
Aliquot neutrofil dihilangkan dengan interval 30 menit dan dicampur dengan air suling steril untuk melisiskan neutrofil dan melepaskan bakteri. Jumlah bakteri hidup dalam setiap alikuot diukur dengan pengenceran serial dan pelapisan pada pelat agar darah.
sebuah†”
Hasilnya diplot pada grafik.
saya. Neutrofil normal menunjukkan pengurangan dua log bakteri intraseluler yang layak setelah satu jam inkubasi.
- Hampir tidak ada pembunuhan oleh neutrofil dari pasien CCD homozigot.
aku aku aku. Neutrofil dari pembawa CGD heterozigot menunjukkan pembunuhan parsial oleh neutrofil.
