Baca artikel ini untuk mengetahui kinerja Uji Ortho-Nitrophenyl Galactoside pada Bakteri untuk Mengetahui Kemampuannya Menghidrolisis Ortho-Nitrophenyl-PD-Galactoside!
Prinsip:
Beberapa bakteri memiliki kemampuan memfermentasi laktosa. Mereka disebut ‘bakteri fermentasi laktosa’ atau ‘penggerak laktosa’.
Yang lain, yang tidak dapat memfermentasi laktosa disebut bakteri non-fermentasi laktosa ‘atau’ non-fomenter laktosa ‘.
Bakteri fermentasi laktosa dapat menghasilkan dua enzim, yaitu ‘permease’ dan ‘β-galactosidase’, yang terlibat dalam fermentasi laktosa. Permease membantu masuknya laktosa ke dalam sel bakteri, sedangkan β-galactosidase menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa, β-galactosidase adalah enzim yang dapat diinduksi intraseluler, yang produksinya diinduksi oleh adanya laktosa di lingkungan sel bakteri.
Sementara bakteri yang memfermentasi laktosa dapat menghasilkan permease dan juga β-galactosidase, bakteri yang tidak memfermentasi laktosa tidak dapat menghasilkan permease, tetapi mungkin atau tidak dapat menghasilkan β-galactosidase. Uji ONPG dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri yang tidak memfermentasi laktosa dalam menghasilkan β-galaktosidase.
Untuk ini, membran sel dari sel bakteri non-fermentasi laktosa dilarutkan dengan menambahkan toluena, untuk melepaskan semua enzim intraseluler termasuk P-galaktosidase, jika ada. Enzim, β-galactosidase, menghidrolisis substrat orto-nitrofenil-β-D-galktosida (ONPG) menjadi orto-nitrofenol, yang berwarna kuning.
Pada uji orto-nitrofenil galaktosida (uji ONPG), bakteri uji ditumbuhkan pada agar miring triple sugar iron agar (TSI agar) yang mengandung laktosa. Jika bakteri adalah laktosa-non-fermentasi, seperti yang ditunjukkan oleh red butt dan red slant, suspensi tebal bakteri dibuat dalam larutan garam, yang ditambahkan toluena diikuti dengan larutan ONPG. Jika bakteri tersebut memiliki kemampuan untuk menghasilkan enzim P-galactosidase, warna suspensi bakteri berubah menjadi kuning.
Bahan yang Dibutuhkan:
Tabung reaksi, labu berbentuk kerucut, sumbat kapas, loop inokulasi, jarum inokulasi, autoklaf, pembakar bunsen, ruang aliran laminar, tabung pembuangan, inkubator, agar TSI, toluena, larutan o-nitrofenil-β-D-galaktosida (ONPG), koloni terisolasi atau biakan murni bakteri.
Prosedur:
- Bahan media agar TSI (mengandung 3 gula dan zat besi sebagai komponen utama) atau bubuk siap pakai yang diperlukan untuk 100 ml media ditimbang dan dilarutkan dalam 100 ml air suling dalam labu berbentuk kerucut 250 ml dengan cara gemetar dan berputar-putar (Gambar 7.16).
- Ditentukan pH-nya menggunakan kertas pH atau pH meter dan diatur menjadi 7,4 menggunakan HCI 0,1N jika lebih atau menggunakan NaOH 0,1N jika kurang.
- Labu dipanaskan untuk melarutkan agar-agar dalam media secara sempurna.
- Sebelum memadat, media dalam keadaan cair hangat disebarkan ke dalam 5 tabung reaksi (masing-masing kurang lebih 20 ml).
- Tabung reaksi ditutup dengan kapas, ditutup dengan kertas kerajinan dan diikat dengan benang atau karet gelang.
- Disterilkan pada suhu 121°C (tekanan 15 psi) selama 15 menit dalam autoklaf.
- Setelah disterilkan dikeluarkan dari autoklaf dan disimpan dalam posisi miring untuk mendinginkan dan memadatkan media, sehingga diperoleh agar miring TSI.
- Bakteri uji diinokulasi secara aseptik, lebih disukai dalam ruang aliran laminar, ke dalam miring dengan menusuk ke pantat dan menggores permukaan miring dengan bantuan jarum yang disterilkan dengan api. Jarum disterilkan setelah setiap inokulasi.
- Slant yang telah diinokulasi diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam dalam inkubator.
- Jika bakteri adalah fermentor laktosa, maka tidak dipilih untuk uji ONPG. Jika bakteri non-fermentor laktosa, yang ditunjukkan dengan red butt dan red slant, dipilih untuk uji ONPG.
- Ke dalam tabung reaksi yang berisi 0,25 ml larutan garam, biakan kental dari bakteri dimasukkan melalui ose yang disterilkan dengan api, untuk membuat suspensi bakteri yang kental.
- Ditambahkan satu tetes toluena, dicampur dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37°C.
- Ditambahkan larutan O-nitrofenil galaktosida (larutan ONPG) dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Kemudian perubahan warna diamati. Sekali lagi perubahan warna diamati setelah 24 jam.
Pengamatan:
- Warna kuning yang dihasilkan: ONPG positif.
- Tetap tidak berwarna: ONPG negatif.
