Baca artikel ini untuk mempelajari percobaan melakukan pewarnaan gram pada bakteri untuk mengetahui apakah itu gram positif atau gram negatif!
Tujuan:
Pewarnaan diferensial terpenting yang digunakan dalam mikrobiologi adalah pewarnaan gram.
Namanya diambil dari Dr. Christian Gram yang mengkategorikan bakteri, berdasarkan perbedaan komposisi dinding selnya, menjadi dua kelompok sebagai berikut:
(1) Bakteri Gram-positif:
Setelah pewarnaan bakteri dengan kristal violet, jika dinding selnya menolak penghilangan warna dengan mencucinya dengan zat penghilang warna (etanol atau aseton), itu adalah bakteri gram positif. Contoh: Bacillus, Staphylococcus.
(2) Bakteri Gram-negatif:
Setelah pewarnaan bakteri dengan kristal violet, jika dinding selnya dibiarkan mengalami penghilangan warna dengan mencucinya dengan zat penghilang warna (etanol atau aseton), itu adalah bakteri gram negatif. Contoh: Escherichia, Salmonella, Vibrio.
Diferensiasi bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif memberikan petunjuk paling penting untuk melangkah lebih jauh ke arah yang tepat untuk identifikasi bakteri yang tidak diketahui. Ini juga berguna untuk diferensiasi sederhana bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Ini juga memberi gambaran tentang bentuk dan susunan sel bakteri.
Prinsip:
Dalam pewarnaan gram, sel-sel bakteri pertama-tama diwarnai dengan pewarna primer, kristal violet yang masuk ke dalam sel dan menodainya dengan warna ungu-biru. Kemudian, sel diperlakukan dengan mordan, yodium gram, yang masuk ke dalam sel dan berikatan dengan noda primer membentuk kompleks pewarna-mordan yang tidak larut (kompleks kristal violet-iodin), sehingga membuat noda sulit keluar.
Kemudian, sel diperlakukan dengan zat penghilang warna, seperti etanol atau aseton. Ini bertindak sebagai pelarut lipid dan sebagai agen dehidrasi protein. Dalam sel gram positif, zat penghilang warna awalnya bertindak sebagai pelarut lipid, melarutkan sejumlah kecil lipid yang ada di dinding sel, sehingga membentuk pori-pori kecil di dalamnya. Selanjutnya, ia mendehidrasi protein dinding sel (peptida), yang menutup pori-pori.
Sekarang, kompleks noda-mordan sulit untuk dihilangkan oleh zat penghilang warna dan sel-sel mempertahankan warna ungu-biru dari noda primer. Saat diwarnai dengan noda berwarna merah muda-merah, safranin, ia tidak dapat masuk ke dalam sel, karena pori-porinya telah tertutup.
Sel-sel akhirnya mempertahankan warna ungu-biru dari noda primer. Di sisi lain, dinding sel gram negatif mengandung lipid (LPS) dalam jumlah besar, yang dilarutkan oleh zat penghilang warna, menghasilkan pembentukan pori-pori besar. Pori-pori ini tidak menutup dengan baik pada dehidrasi protein dinding sel.
Itulah mengapa; kompleks noda-mordan lolos melalui pori-pori, ketika dicuci dengan agen penghilang warna dan sel-sel tampak tidak berwarna. Ketika diwarnai oleh safranin, ia masuk ke dalam sel melalui pori-pori dan akhirnya sel mengambil warna merah muda-merah dari noda.
Bahan yang Dibutuhkan:
Slide, loop, pewarna primer (kristal violet), mordan (yodium gram), agen penghilang warna (etanol 95%), pewarna lawan (safranin), kultur bakteri kaldu/miring/piring, mikroskop, minyak imersi.
Prosedur:
- Slide dibersihkan dengan benar di bawah air ledeng, sehingga air tidak tertinggal sebagai tetesan di permukaannya (Gambar 5.11).
- Air yang menempel diseka dengan kertas bibulous dan slide dikeringkan dengan udara.
- Apusan bakteri disiapkan di tengah kaca objek dengan dua metode sebagai berikut.
(sebuah) Jika suatu bakteri yang tumbuh pada cawan agar atau agar miring akan diamati, setetes air diletakkan di tengah kaca objek dan ose bakteri dari cawan atau slant dipindahkan ke sana dengan ose yang disterilkan di atas api. Kemudian, dengan memutar loop secara perlahan pada tetesan, suspensi bakteri dibuat dan disebarkan hingga diperoleh apusan.
(b) Jika bakteri yang tumbuh dalam kaldu cair akan diamati, setetes suspensi bakteri ditempatkan langsung di tengah kaca objek dengan ose yang disterilkan dengan api dan apusan dibuat dengan menyebarkannya.
- Apusan dikeringkan dengan udara.
- Apusan difiksasi dengan pemanasan. Pemanasan menghasilkan koagulasi protein seluler, sehingga sel menempel pada permukaan slide dan tidak hanyut selama pewarnaan. Fiksasi panas dilakukan dengan melewatkan slide secara cepat di atas nyala api 2-3 kali, dengan apusan. permukaan menghadap ke atas, sehingga apusan tidak memanas.
- Slide disimpan di atas nampan pewarnaan dan dibanjiri dengan pewarna primer, crystal violet, selama 1 menit.
- Noda berlebih dibersihkan dari apusan di bawah air keran yang mengalir lembut, sedemikian rupa sehingga air tidak jatuh langsung ke apusan.
- Apusan digenangi dengan mordan yodium gram selama 1 menit.
- Kelebihan mordan dicuci dari apusan di bawah air keran yang mengalir dengan lembut, sedemikian rupa sehingga air tidak jatuh langsung ke apusan.
- Apusan dibanjiri dengan zat penghilang warna, etanol 95%, selama 5 detik, dengan hati-hati, agar apusan tidak luntur secara berlebihan.
- Etanol segera dibersihkan dari apusan dengan air keran yang mengalir dengan lembut, untuk mencegah penghilangan warna yang berlebihan. Perawatan diambil, sehingga air tidak jatuh langsung pada smear.
- Apusan dibanjiri dengan pewarna tandingan, safranin, selama 1 menit.
- Counter-stain yang berlebih dibersihkan dari smear di bawah air keran yang mengalir dengan lembut, sedemikian rupa sehingga air tidak jatuh langsung ke smear.
- Slide dikeringkan dengan kertas bibulous.
- Slide dijepitkan ke panggung mikroskop dan apusan diamati dengan daya rendah dan objektif kering tinggi.
- Setetes minyak imersi dioleskan pada apusan.
- Apusan diamati dengan objektif oil-immersion.
Pengamatan (Under Oil-immersion Objective):
- Warna sel:
Ungu-biru: Bakteri gram positif
Merah muda-merah: bakteri Gram-negatif
- Bentuk bakteri:
Bulat (coccus)
Berbentuk batang (basil)
Seperti koma (vibrio)
Spiral (spirocheta)
- Susunan bakteri:
Pasangan (diplobacillus/diplococcus)
Dalam empat (tetrad)
Berantai (streptococcus/streptobacillus)
Cluster seperti anggur (staphylococcus)
Kuboid (sarcinae atau oktet)
- Ukuran bakteri:
Dengan perkiraan mata, buatlah gambar bidang di bawah tujuan perendaman minyak.
Reaksi Variabel Gram:
Dalam beberapa kasus, sel gram positif muncul sebagai sel gram negatif. Ini disebut reaksi gram-variabel.
Alasannya adalah sebagai berikut:
(a) Dekolorisasi berlebihan dapat terjadi, yang menyebabkan sel-sel gram positif juga kehilangan warna ungunya.
(b) Fiksasi berlebih dapat terjadi, yang menyebabkan sel-sel gram positif kehilangan kemampuannya untuk menahan dekolorisasi
(c) Jika biakan bakteri lama digunakan, komponen dinding sel dapat berubah seiring bertambahnya usia sel yang memungkinkan terjadinya dekolorisasi.
