Eksperimen Mengisolasi Coliphage dari Virus (dengan diagram)

Eksperimen untuk Mengisolasi Coliphage dari Virus!

Prinsip:

Bakteriofag atau phage (virus) yang menginfeksi bakteri, Escherichia coli disebut coliphage (coli: E. coli-, phage: bacteriophage).

Itu dapat diperoleh dari berbagai sumber alami, seperti tanah, kotoran dan limbah mentah. Isolasinya dari sumber-sumber ini tidak mudah, karena hadir dalam konsentrasi rendah.

Oleh karena itu, pertama jumlahnya ditingkatkan dengan langkah pengayaan, di mana biakan yang kaya dari bakteri inang (yaitu E. coli) ditambahkan ke sampel yang mengandung coliphage dan diinkubasi. Kolofag menginfeksi E. coli dan bertambah banyak jumlahnya. Kultur kaya coliphage ini disentrifugasi untuk mengendapkan materi partikulat.

Sedimen dibuang dan supernatan disaring melalui filter mikroba untuk menahan bakteri dan partikel lainnya, sambil membiarkan coliphage melewatinya. Filtratnya, yang kaya akan coliphage, digunakan untuk menyemai suspensi E. coli, yang kemudian dibiarkan tumbuh sebagai rumput konfluen di atas piring agar.

Kolofag tumbuh di dalam sel E. coli dan melisiskannya. Lisis sel-sel bakteri menghasilkan pembentukan zona bening pada halaman pertemuan bakteri. Zona bening ini disebut plak. Setiap zona bening diasumsikan dibentuk oleh satu coliphage.

Bahan yang Dibutuhkan:

Pipet, labu berbentuk kerucut, cawan petri, tabung reaksi, sumbat kapas, pembakar bunsen, tabung pembuangan, sentrifus, alat filtrasi membran, ruang aliran laminar, autoklaf, inkubator, kaldu bakteriofag, agar lunak tripton, agar keras tripton, kultur kaldu nutrisi dari bakteri Escherichia coli (misalnya, E. coli B), sampel (misalnya, limbah mentah).

Prosedur:

1. Lima pipet (dalam kotak pipet stainless steel) dan lima cawan petri disterilkan dalam oven udara panas pada suhu 180°C selama 3 jam. Alternatifnya, mereka dapat ditutup dengan kertas kerajinan, diikat dengan benang atau karet gelang dan disterilkan dalam autoklaf bersama dengan medianya (Gambar 8.5).

2. Bahan-bahan media kaldu bakteriofag atau bubuk siap pakainya, yang diperlukan untuk 100 ml media ditimbang, dilarutkan dalam 100 ml air suling dalam labu berbentuk kerucut 250 ml dan pH diatur menjadi 7,6. Labu ditutup dengan kapas, ditutup dengan kertas kerajinan dan diikat dengan benang atau karet gelang.
3. Bahan media tryptone soft agar atau bubuk siap pakainya, diperlukan untuk 100 ml media ditimbang, dilarutkan dalam 100 ml air suling dalam labu berbentuk kerucut 250 ml dan pH diatur menjadi 7,5.
4. Media cair ini disebarkan ke dalam 5 tabung reaksi (masing-masing 2 ml), disumbat dengan kapas, ditutup dengan kertas kerajinan dan diikat dengan benang atau karet gelang.
5. Bahan-bahan media agar keras tripton atau bubuk siap pakai yang diperlukan untuk 100 ml media ditimbang dan dilarutkan dalam 100 ml air suling dalam labu berbentuk kerucut 250 ml dengan pemanasan setelah penyesuaian pH hingga 7,5. Labu ditutup dengan kapas, ditutup dengan kertas kerajinan dan diikat dengan benang atau karet gelang.
6. Labu berisi kaldu bakteriofag, 5 tabung agar lunak tripton, labu berisi media agar keras tripton dan labu berbentuk kerucut 250 ml sumbat kapas kosong disterilkan pada suhu 121 °C (tekanan 15 psi) selama 15 menit dalam autoklaf .
7. Media hard agar tryptone yang telah disterilkan dalam labu conical dituang ke dalam 5 cawan petri steril secara aseptis dan dibiarkan dingin, sehingga diperoleh 5 cawan agar hard tryptone.
8. Ke dalam labu corong 250 ml kosong yang disterilkan dengan sumbat kapas, 5 ml kaldu bakteriofag steril, 5 ml biakan kaldu E. coli B dan 45 ml limbah mentah dipindahkan secara aseptik, sebaiknya dalam ruang aliran laminar (Gambar 8.6) .

9. Labu tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam, agar kolifag dalam limbah dapat berkembang biak di dalam sel bakteri inang (sel E. coli B).
10. Isi labu dituangkan ke dalam tabung sentrifus 100 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm selama 20 menit dalam sentrifus untuk mengendapkan partikel. Sedimen dibuang.
11. Supernatan, kaya akan coliphage, disaring melalui alat filtrasi membran. Residunya dibuang.
12. Lima tabung agar lunak tripton yang telah disterilkan diambil dan dipanaskan di atas penangas air dengan suhu 100°C, sehingga agar agar meleleh. Tabung didinginkan dan dipertahankan pada suhu 45°C di atas penangas air.
13. Menggunakan pipet steril, 1, 2, 3, 4 dan 5 tetes filtrat bebas bakteri, kaya coliphage dipindahkan secara aseptik ke lima tabung agar lunak tryptone.
14. Ke setiap tabung agar lunak tryptone, 0,1 ml kultur kaldu nutrisi Escherichia coli B dipindahkan secara aseptik.
15. Isi dari lima tabung agar lunak tryptone yang mengandung virus, coliphage dan bakteri, E. coli B dengan cepat bercampur dengan memutar tabung di antara telapak tangan.
16. Isinya dituangkan di atas lima lempeng agar keras tryptone (berlabel 1 sampai 5 tetes), sehingga membentuk sediaan biakan lempeng lapisan ganda. Pelat diaduk dengan lembut dan dibiarkan mengeras.
17. Pelat yang telah diinokulasi diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 37°C selama 24 jam dalam inkubator.

Pengamatan:

1. Semua pelat diamati untuk unit pembentuk plak (PFU) yang berkembang sebagai zona bening di halaman rumput bakteri. Pembentukan plak merupakan indikasi adanya coliphage dalam kultur.
2. Setiap plak mewakili pertumbuhan yang kaya dari coliphage yang terisolasi.
3. Jumlah plakat dihitung pada semua pelat dan ditabulasikan sebagai berikut (Tabel 8.1).

Tabel 8.1 Pengamatan jumlah coliphage :