Bertujuan untuk melakukan uji pemanfaatan sitrat, untuk mengetahui kemampuan suatu bakteri dalam memanfaatkan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon.
Prinsip:
Beberapa bakteri memiliki kemampuan untuk tumbuh pada media tanpa C dan N organik.
Mereka dapat memanfaatkan natrium sitrat sebagai satu-satunya sumber C dan amonium dihidrogen fosfat (NH 4 H 2 P0 4 ) sebagai satu-satunya sumber N. Mereka memanfaatkan NH 4 H 2 P0 4 untuk mendapatkan N dengan produksi NH 3 , yang meningkatkan pH mengakibatkan terjadinya perubahan warna bromotimol biru dari hijau (pH = 6,9) menjadi biru (pH di atas 7,6).
Pada uji pemanfaatan sitrat, bakteri uji ditumbuhkan pada agar miring yang tidak mengandung C atau N organik, melainkan mengandung natrium sitrat, NH 4 H 2 P0 4 dan bromotimol biru. Jika bakteri memiliki kemampuan untuk memanfaatkan sitrat sebagai satu-satunya sumber C, hal itu menunjukkan pertumbuhan pada lereng. Ini juga memanfaatkan NH 4 H 2 P0 4 sebagai satu-satunya sumber N yang menghasilkan perubahan warna lereng dari hijau menjadi biru.
Bahan yang Dibutuhkan:
Tabung reaksi, labu berbentuk kerucut, sumbat kapas, jarum inokulasi, autoklaf, pembakar bunsen, ruang aliran laminar, tabung pembuangan, inkubator, agar Simmons sitrat, koloni terisolasi atau biakan murni bakteri.
Prosedur:
- Bahan media agar simmons sitrat (mengandung natrium sitrat, NH 4 H, P0 4 dan bromotimol biru sebagai bahan utama) atau serbuk siap pakai yang dibutuhkan sebanyak 100 ml media ditimbang dan dilarutkan dalam 100 ml air suling air dalam labu berbentuk kerucut 250 ml dengan mengocok dan memutar (Gambar 7.6).
- Ditentukan pH-nya menggunakan kertas pH atau pH meter dan diatur menjadi 6,9 menggunakan HC1 0,1N jika lebih banyak atau menggunakan NaOH 0,1N jika lebih sedikit.
- Labu dipanaskan untuk melarutkan agar-agar dalam media secara sempurna.
- Sebelum memadat, media dalam keadaan cair hangat disebarkan ke dalam 5 tabung reaksi (masing-masing kurang lebih 20 ml).
- Tabung reaksi ditutup dengan kapas, ditutup dengan kertas kerajinan dan diikat dengan benang atau karet gelang.
- Disterilkan pada suhu 121°C (tekanan 15 psi) selama 15 menit dalam autoklaf.
- Setelah disterilkan, dikeluarkan dari autoklaf dan disimpan dalam posisi miring untuk mendinginkan dan memadatkan media, sehingga diperoleh agar sitrat miring.
- Bakteri uji diinokulasi secara aseptik, lebih disukai dalam ruang aliran laminar, ke dalam miring dengan menusuk ke pantat dan menggores permukaan miring dengan bantuan jarum yang disterilkan dengan api. Jarum disterilkan setelah setiap inokulasi.
- Slant yang telah diinokulasi diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 sampai 48 jam dalam inkubator.
Pengamatan:
- Pertumbuhan miring dan perubahan warna dari hijau menjadi biru: Pemanfaatan sitrat positif.
- Tidak ada pertumbuhan dan warna tetap hijau: Penggunaan sitrat negatif.
