Dalam reaksi kimia yang dikatalisis oleh enzim, enzim menurunkan jumlah energi aktivasi yang dibutuhkan dengan berikatan sementara dengan substrat dan memutarnya menjadi keadaan tegang. K(katalis) atau “kcat” untuk reaksi mengacu pada konstanta bebas konsentrasi untuk laju di mana enzim tertentu dapat memetabolisme substrat menjadi molekul produk. Untuk menghitung kcat, para ilmuwan pertama-tama mencampur beberapa tabung reaksi dengan berbagai konsentrasi substrat (dikenal sebagai “pengujian enzimatik”) dan mengujinya pada interval waktu yang konstan dengan spektrofotometer cahaya untuk mengukur peningkatan konsentrasi molekul produk. Data ini kemudian diplot ke grafik dan dianalisis.
Menghitung Kecepatan Awal
Plot grafik konsentrasi produk versus waktu untuk data dari tabung reaksi pertama uji enzimatik. Catatan: sumbu horizontal harus “waktu”, dan sumbu vertikal harus “konsentrasi produk”.
Hitung garis regresi linier untuk titik data yang Anda gambarkan di Bagian 1, Langkah 1. Meskipun Excel dan kalkulator grafik dapat dengan mudah menentukan model linier ini, Anda dapat memperoleh perkiraan kemiringan garis regresi dengan membagi perbedaan konsentrasi produk antara data yang berdekatan poin dengan perbedaan waktu mereka.
Catat kemiringan garis regresi linier dari Bagian 1, Langkah 2 sebagai “kecepatan reaksi awal (Vo).” Catatan: dalam model garis regresi “[konsentrasi produk] = m [waktu] + b,” koefisien “m” adalah kemiringan.
Ulangi Langkah 1, 2 dan 3 untuk sisa tabung reaksi dalam pengujian.
Menghitung Vmaks
Plot kebalikan dari konsentrasi substrat untuk setiap tabung reaksi versus kebalikan dari kecepatan reaksi awalnya (dari Bagian 1, Langkah 4). Misalnya, jika kecepatan awal untuk tabung reaksi dengan konsentrasi substrat awal 50 mikromolar (uM) adalah 80 uM/s, kebalikannya adalah 1/50 uM untuk konsentrasi substrat dan 1/80 uM/s untuk konsentrasi awal. kecepatan. Catatan: konsentrasi substrat terbalik harus berada pada sumbu horizontal, dan kecepatan awal terbalik harus berada pada sumbu vertikal.
Catatan: konsentrasi substrat harus berada pada sumbu horizontal, dan kecepatan reaksi awal harus berada pada sumbu vertikal.
Tentukan garis regresi linier untuk bagan yang Anda gambarkan di Bagian 2, Langkah 1. Catatan: karena Anda perlu mengetahui perpotongan y untuk garis regresi, Anda harus memasukkan poin dari Bagian 2, Langkah 1 ke Excel atau kalkulator grafik dan gunakan fungsionalitas pemodelan regresi bawaan.
Bagilah 1 dengan perpotongan y dari garis regresi linier. Ini akan memberi Anda nilai kebalikan dari Vmax, kecepatan reaksi maksimum untuk enzim. Catatan: jika model regresi linier berbentuk “[Inverse Vo] = m [Inverse Substrate Conc.] + b,” maka nilai “b” akan menjadi perpotongan y. Bagilah 1 dengan “b” untuk menghitung kebalikan dari Vmax.
Bagilah 1 dengan hasil dari Bagian 2, Langkah 3 untuk menghitung nilai sebenarnya dari Vmax.
Tentukan konsentrasi enzim dalam pengujian asli (lihat data mentah). Catatan: konsentrasi enzim sama untuk semua tabung reaksi; hanya konsentrasi substrat yang bervariasi dalam pengujian.
Bagilah Vmax (dari Bagian 2, Langkah 4) dengan konsentrasi enzim (dari Bagian 2, Langkah 5). Hasilnya adalah nilai Kcat.
gambar tube de chimie oleh Danielle Bonardelle dari Fotolia.com
