Transfer Gen yang Dimediasi Agrobacterium pada Tanaman!
Agrobacterium adalah bakteri patogen gram negatif yang terlibat dalam menyebabkan penyakit pembentukan mahkota empedu pada spesies tanaman. Pembentukan empedu mahkota disebabkan oleh transfer segmen DNA onkogenik (penyebab kanker) ke dalam sel tumbuhan di tempat luka.
Segmen DNA ini (transfer DNA atau T-DNA) terdapat pada plasmid besar yang disebut plasmid penginduksi tumor (Ti) dalam bakteri. T-DNA (panjang sekitar 20 kb) diintegrasikan ke dalam kromosom tanaman melalui rekombinasi. Serangkaian gen virulensi (vir) terlibat dalam mengarahkan proses infeksi. Jadi ketika akar atau batang tanaman dilukai, ia memberikan respons tertentu.
Menanggapi sinyal tersebut, gen vir dari A. tumefactions menjadi aktif, dan mengarahkan serangkaian peristiwa yang diperlukan untuk transfer T-DNA dari plasmid Ti ke kromosom tanaman. Fungsi gen vir yang berbeda termasuk salinan T-DNA, diikuti oleh penempelan produk ke untai T-DNA yang disalin untuk bertindak sebagai pemimpin, selanjutnya menambahkan protein bersama dengan panjang T-DNA, mungkin sebagai pelindung. mekanisme.
Ini akhirnya membuka saluran di membran sel bakteri, yang dilalui T-DNA. T-DNA kemudian memasuki tanaman melalui luka. Namun, masih belum jelas bagaimana DNA bakteri berpindah dari sitoplasma ke inti sel tanaman, atau bagaimana T-DNA menjadi terintegrasi ke dalam kromosom tanaman.
Untuk menggunakan bakteri ini sebagai vektor, daerah T-DNA-nya dihilangkan kecuali daerah perbatasan dan gen vir. Transgen tersebut kemudian disisipkan di antara daerah T-DNA, di mana ia dipindahkan ke sel tanaman dan diintegrasikan ke dalam kromosom tanaman (Gbr. 1). T-DNA diklon dalam Ti-plasmid, yang dipotong sesuai ukuran dan direplikasi dalam E.coli untuk memfasilitasi manipulasi lebih lanjut. Vektor ini dimobilisasi menjadi strain inang Agrobacterium dan digunakan untuk menginfeksi jaringan tanaman.
Jaringan tanaman yang terinfeksi ini selanjutnya ditumbuhkan pada media yang mengandung bahan kimia tertentu, zat pengatur tumbuh untuk memfasilitasi regenerasi sel yang berubah. Pemilihan transforman dilakukan dengan adanya antibiotik yang ada dalam media kultur. Tanaman yang ditransformasi akhirnya dianalisis untuk integrasi yang stabil dan analisis fungsional dari gen yang disisipkan.
Fusi Protoplas:
Sel tanpa dinding sel disebut sebagai protoplas. Protoplas ini dapat mengambil DNA secara langsung di hadapan bahan kimia tertentu (seperti polietilen glikol, PEG). Konsentrasi PEG yang lebih tinggi menyebabkan permeabilisasi membran plasma, yang memungkinkan pengambilan DNA ke dalam protoplas. Bahkan sinyal listrik dapat digunakan untuk membuat lubang kecil pada membran plasma dengan mengalirkan arus listrik.
Ini dikenal sebagai elektroporasi. Lubang kecil ini kemudian membantu pengambilan DNA asing oleh protoplas. Ini kemudian diikuti oleh pembentukan dinding sel dan inisiasi pembelahan sel. Namun, produksi tanaman transgenik melalui transfer gen langsung ke protoplas bergantung pada sistem regenerasi protoplas ke tanaman yang efisien.
Gene-gun atau Transfer Gen Biolistik:
Ini adalah teknik terbaru di mana seseorang dapat mengirimkan DNA yang diinginkan ke dalam sel dengan memuat partikel mikro (seperti emas atau tungsten) dengan kecepatan tinggi. Proses pengiriman DNA ini disebut bombardir. Di dalam sel, molekul DNA dilepaskan dari partikel dan akhirnya DNA ini terintegrasi ke dalam genom inti atau organel sel inang.
Eks-tanaman jaringan tersebut akhirnya dikulturkan pada media yang mengandung hormon/antibiotik tertentu untuk menyeleksi tanaman hasil transformasi. Setelah gen yang diinginkan dipindahkan ke inang yang diinginkan, integrasi stabilnya perlu dilakukan yang dilakukan dengan meregenerasi tanaman. Hal ini dicapai dengan teknik kultur jaringan.
Proses kultur jaringan secara garis besar dapat dibagi menjadi empat tahap:
Tahap I:
Termasuk pemilihan eksplan yang sesuai dan pemindahannya ke media nutrisi.
Tahap II:
Termasuk proliferasi jaringan yang tumbuh pada media multiplikasi.
Tahap III:
Termasuk pemindahan jaringan tumbuh (kalus) ke media yang dapat berdiferensiasi menjadi berbagai bagiannya.
Tahap IV:
Termasuk pemindahan planlet ke lingkungan alam. Namun, gen yang menarik dapat ditambahkan dalam dua cara sebagai orientasi akal dan antisense. Untuk mengekspresikan atau mengekspresikan gen secara berlebihan, seseorang dapat menempatkan gen dalam orientasi indra. Namun, jika seseorang ingin memblokir produk yang tidak diinginkan atau langkah dalam jalur biokimia, seseorang dapat menempatkan gen dalam orientasi antisense.
